植物在生长发育过程中会遭受多种生物与非生物胁迫的侵袭，而病程相关蛋白(Pathogenesis-related proteins，PRs)是植物受这些外界胁迫时诱导产生的一类特异性防御蛋白，是植物防御体系的重要组成部分^{[1, 2]}。根据PRs蛋白生物活性、亲缘关系和结构的不同，可将其分为17个家族^{[3, 4]}。PR10属病程相关蛋白第10家族，为类核糖核酸酶，是一类等电点偏酸性的小分子(分子量为15 ~ 19 kD)胞内蛋白，通常编码151 ~ 162个氨基酸，广泛存在于植物细胞质中^[5-7]。研究表明，PR10能降解病原体核酸或引发植物感染部位的细胞程序性死亡(Programmed cell death, PCD)^[8]，帮助植物抵御病原菌的侵染。自1988年PR10基因从欧芹(Petroselinum crispum (Mill) Hill)^[9]中首次分离鉴定后，该基因在不同植物中被相继发现，包括大豆(Glycine max (L.) Merr.)^[10]、高粱(Sorghum Bicolor (L.) Moench)^[11]、三七(Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen)^[12]、海岛棉(Gossypium barbadense L.)^[13]等。松科是针叶树中最大的科，约有11属120种^{[14, 15]}。目前松科部分属的PR10基因已被挖掘，包括松属糖松(Pinus lambertiana Dougl.)^[16] 的Pinl Ⅰ基因、西部白松(Pinus monticola Dougl)^[17]的Pin m Ⅲ基因，黄杉属北美黄杉(Pseudotsuga menziesii (Mirbel) Franco)^[18]的Pse m Ⅰ基因，云杉属白云杉(Picea glauca (Moench) Voss)^[17]的Picg1基因等。

粗枝云杉(Picea asperata Mast.)为松科云杉属植物，又名大果云杉、云杉等，多年生常绿针叶乔木，广泛分布于我国西南地区，是重要的用材树种和工业原料提取树种^{[19, 20]}。调查发现，粗枝云杉长期遭受云杉落针病(Lophodermium piceae (Fuckel) V. Hohn)的侵扰，造成其生长受阻，用材质量大大降低^[21]。抗病育种是林木病害防治的有效途径之一，挖掘粗枝云杉抗病基因资源，为培育广谱持久的抗落针病云杉树种奠定研究基础。然而目前，粗枝云杉抗病基因仅有少数报道，包括苯丙氨酸氨裂解酶基因(PaPAL)^[22]和防御素基因(PaDef)^[23]等，但PR10基因在粗枝云杉中还未见报道。

本实验室在前期研究中对云杉落针病菌胁迫的粗枝云杉进行了转录组测序，筛选到一个病原菌胁迫下显著上调的PaPR10-1基因(数据未发表)，利用RT-PCR技术克隆获得该基因的全长cDNA序列，通过生物信息学方法分析基因序列及其编码的氨基酸序列，将PaPR10-1基因连接到pET-32a载体上并转入BL21(DE3)感受态细胞中重组表达，对其表达的IPTG诱导浓度、诱导时间和诱导温度等条件进行优化。在最佳表达条件下表达目的蛋白并纯化，并采用底物分析法检测纯化蛋白的RNase活性。研究结果旨在为进一步解析PaPR10-1基因在粗枝云杉抗病中的生物学功能奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

粗枝云杉一年生健康幼嫩针叶采自四川省甘孜藏族自治州泸定县二郎山林场；云杉落针病菌云杉散斑壳(Lophodermium piceae (Fuckel) V. Hohn)来源于四川农业大学微生物标本保藏室。

1.2   PaPR10-1基因的克隆

提取粗枝云杉总RNA，并反转录成cDNA。使用Primer 5.0软件设计PaPR10-1基因特异性引物，分别为PaPR10-1-F和PaPR10-1-R (表1)。以cDNA为底物，利用设计好的引物序列进行PCR扩增，程序如下：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，54℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共40个循环；72℃延伸7 min，于4℃保存。扩增产物经纯化、回收后转入DH5α感受态细胞中，阳性克隆送公司测序。

表  1  引物序列

Table  1.  Primer sequences

引物名称 Primer name	引物序列 (5'→3') Primer sequence (5'→3')
PaPR10-1-F	ATGGTGGCAGGGACGGTAACAAC
PaPR10-1-R	TTAGCAGTATAAGTCGGGGTTGGAG
PaPR10-1-BamHⅠ-F	GGAATTCATGGTGGCAGGGACGGTAACAAC
PaPR10-1-HindⅢ-R	CCGCTCGAGTTAGCAGTATAAGTCGGGGTTGGAG

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1.3   生物信息学分析

通过序列分析软件DNAMAN 6.0对PaPR10-1基因的核苷酸和其编码的氨基酸序列进行比对分析，利用ESPript3.0、ScanProsite、SOPMA和SWISS-MODEL（https: //swissmodel.expasy.org/interactive）等在线工具进行序列比对、疏水性和蛋白二、三级结构等相关的生物信息学分析，利用MEGA 4.1软件绘制PaPR10-1蛋白及其同源序列的系统进化树，并于在线网站Evolview上进行美化。

1.4   PaPR10-1基因原核表达载体的构建

以纯化质粒pMD19-T-PaPR10-1为模板，利用特异性引物PaPR10-1-BamHⅠ-F和PaPR10-1-HindⅢ-R(表1)扩增含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点且不含信号肽的PaPR10-1基因序列。PCR反应程序同1.2。回收特异性片段，利用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切目的片段和pET-32a载体，纯化回收酶切产物后转入DH5α感受态细胞中，阳性克隆送测序。

1.5   重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE分析

将构建好的表达载体质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落于含100 μg/mL Amp的LB液体培养基中，于37℃、200 r/min 过夜振荡培养。对诱导重组蛋白表达的IPTG浓度、时间和温度等条件进行优化。浓度梯度为：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L；时间梯度为：2、4、6、8、10 h；温度梯度为：20℃、25℃、30℃、37℃。样品处理及SDS-PAGE参见刘裕峰等^[24]的方法。

1.6   重组蛋白的纯化和RNase活性测定

利用His标签蛋白纯化试剂盒对重组蛋白进行纯化，SDS-PAGE电泳检测纯化结果。提取云杉散斑壳菌总RNA。参考谢纯政等^[25]的方法，稍作修改：取5份等量的云杉散斑壳菌总RNA，分别加入5 μL DEPC水、5 μL洗脱液、2.5 μL RNA酶清除剂 + 2.5 μL纯化PaPR10-1蛋白、5 μL纯化PaPR10-1蛋白、5 μL RNA酶清除剂，37℃下反应0.5 h，1%琼脂糖凝胶电泳检测云杉散斑壳菌RNA降解效果。

参考任晋宏等^[26]方法，以酵母tRNA为底物，以提前加入氯化锂的样品为对照，每个处理3个重复。 酶活定义：在37℃、pH值6.0反应条件下，每分钟使A260吸收值变化1.0的酶量定义为一个活性单位U，通过考马斯亮蓝法检测纯蛋白的浓度，换算得到PaPR10-1的比活(U/ mg)。

2.   结果与分析

2.1   PaPR10-1基因全长cDNA克隆及序列分析

本研究以粗枝云杉cDNA为模板扩增PaPR10-1基因(GenBank号：2552489)，电泳检测得到一条约500 bp的条带(图1)。序列分析结果显示，该片段长度为486 bp，PaPR10-1基因序列包含一个完整的开放阅读框(ORF)，共编码161个氨基酸(图2)。该基因的核苷酸序列与北美云杉(Picea sitchensis (Bong.) Carr.) (GenBank号：ABK22402.1)的PR10序列相似性高达94%以上，表明PaPR10-1基因为PR10基因家族的一员。

图  1  PaPR10-1 基因PCR产物

Figure  1.  PCR product of PaPR10-1 gene

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图  2  PaPR10-1 基因 cDNA序列及其编码的氨基酸序列

方框为“P-Loop”保守基序(GXGGXG) ；横线为潜在的磷酸化位点。

Figure  2.  PaPR10-1 gene cDNA sequence and its encoded amino acid sequence

Box is “P-Loop” conservative base order (GXGGXG); black bottom line is potential phosphorylation site.

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2.2   氨基酸理化性质分析

蛋白理化性质分析结果显示：PaPR10-1蛋白的相对分子质量为17.65 kD，分子式为C₇₈₆H₁₂₅₄N₂₀₀O₂₄₅S₇；理论等电点为5.02；PaPR10-1肽链由20种氨基酸组成，其中酸性氨基酸(sp + Glu)共23个，碱性氨基酸(rg + Lys)共18个；由于该肽链只含1个His，推测其对金属离子的结合能力较弱。该蛋白不稳定指数为31.87，脂肪指数为89.63，总平均亲水系数为−0.234，推测PaPR10-1蛋白是一种稳定的亲水性蛋白。在线工具SignalP和TMHMM分析结果表明，PaPR10-1蛋白无信号肽和跨膜结构域。NetPhos预测PaPR10-1蛋白氨基酸序列具有12个潜在的磷酸化位点。此外，ScanProsite分析其功能位点，发现该蛋白存在5种可能的翻译后修饰位点，包括：5个N-肉豆蔻酰化原位点、4个络蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、1个蛋白激酶C磷酸化位点、1个N-糖基化位点和1个ATP_GTP_A( p环)位点。

2.3   亚细胞定位预测及疏水性分析

亚细胞定位分析结果表明，该蛋白定位于细胞质和线粒体中的可能性最大，属于胞内蛋白。在PaPR10-1蛋白的34 ~ 43区域、100 ~ 104区域及115 ~ 118区域具有较强的疏水性，其中疏水性最强的是41和42个氨基酸处，疏水性高达1.767 (图3)。

图  3  PaPR10-1疏水性分析

Figure  3.  Hydrophobicity analysis of PaPR10-1

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2.4   蛋白质二、三级结构预测分析

PaPR10-1蛋白的二级结构主要由4部分组成(图4：A)，其中α-螺旋(Alpha helix)占比最高，为29.19%；其次为无规则卷曲(Random coil)，占29.19%；延伸链(Extended strand)占21.12%；最少的为β-转角(Beta turn)，占比9.32%。PaPR10-1蛋白三级结构预测结果显示(图4：B)，该蛋白由一个PDB号为4bkd.1的结构为模板建立，4bkd.1属于主要花粉过敏原BET V 1-A( MAJOR POLLEN ALLERGEN BET V 1-A)，序列相似性为0.38，范围为2 ~ 161 aa，氨基酸覆盖率达99%。

图  4  PaPR10-1蛋白二级结构预测与分析(A)以及蛋白三级结构预测(B)

A：蓝色表示α-螺旋；紫色表示无规则卷曲；红色表示延伸链；绿色表示β-转角；横向数值表示氨基酸位置。

Figure  4.  Secondary structure prediction and analysis of PaPR10-1 protein (A) and tertiary structure prediction of (B)

A: Blue indicates α-helix; purple represents random coil; red indicates extended strand; green indicates β-turn; lateral value indicates amino acid position.

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2.5   蛋白序列保守性及同源性分析

利用NCBI的CDD (Conserved domain database)数据库分析发现，PaPR10-1蛋白具有glycine-rich loop 保守基序和Bet_v1-like保守疏水结构域，属于SRPBCC超家族。对粗枝云杉PaPR10-1蛋白序列及北美云杉、西部白松、海岸松(Pinus pinaster Aiton)、硬粒小麦(Triticum durum Desf.)、小麦(T. aestivum L.)、高粱的PR10蛋白序列进行同源性分析(图5)，发现其序列较为保守，其中粗枝云杉PR10蛋白与北美云杉的序列一致性最高，达到了94%，与海岸松的序列一致性达80%，与西部白松的一致性为76.4%，与小麦和硬粒小麦的一致性同为40.91%，与高粱的一致性为39.87%。

图  5  PaPR10-1与6种植物PR10的多重序列比对

AAL50007.1：西部白松；ADJ53040.1：海岸松；QEQ43328.1：硬粒小麦；ACG68733.1：小麦；AAW83210.1：高粱；ABK22402.1：北美云杉。箭头表示β-折叠，字母TT表示β-转角，波浪线表示α-螺旋。

Figure  5.  Multiple alignments of amino acid sequence of PaPR10-1 and six plant PR10s

AAL50007.1: Pinus monticola Dougl.; ADJ53040.1: Pinus pinaster Aiton; QEQ43328.1: Triticum durum Desf.; ACG68733.1: Triticum aestivum L.; AAW83210.1: Sorghum Bicolor (L.) Moench; ABK22402.1: Picea sitchensis (Bong.) Carr. Arrows indicate β-pleated sheets, TT indicates β-turns, squiggles indicate α-helix.

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2.6   系统进化分析

为了解粗枝云杉PaPR10-1蛋白与其他植物的PR10之间的进化关系，本研究构建了PR10蛋白家族系统进化树。结果表明(图6)，该进化树主要分为双子叶植物、裸子植物和单子叶植物、苔藓植物3大支，发现PR10家族广泛分布于植物界且在进化过程中高度分化。而裸子植物与单子叶的PR10聚为一支，暗示两者的PR10蛋白可能来源于同一祖先^[27]。同一科属或同一物种不同亚型的PR10大多聚在一个小支上，说明PR10蛋白具有一定的低种内变异和高种间变异特性^[28]。其中粗枝云杉与海岸松的PR10蛋白亲缘关系最近，而与双子叶植物和苔藓植物亲缘关系较远。

图  6  PR10系统进化树分析

红色为双子叶植物，黄色为裸子植物，绿色为单子叶植物，蓝色为苔藓植物。

Figure  6.  Phylogenetic tree analysis of PR10

Red indicates dicot, yellow indicates gymnosperms, green indicates monocot, blue indicates bryophyte.

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2.7   原核表达载体的构建及诱导条件优化

本研究将扩增得到的PaPR10-1 基因片段连接到pET-32a表达载体上，得到了与目的基因大小一致的条带(图7)。将测序成功的重组质粒利用IPTG诱导优化表达。诱导浓度筛选结果显示(图8: A)，对照无融合蛋白表达，不同IPTG浓度诱导下均有目的蛋白出现且无明显差别，故确定IPTG终浓度0.2 mmol/L为最佳诱导浓度进行诱导时间实验。不同诱导时间下均能诱导出目的蛋白(图8: B)，但随着诱导时间的增加，目的蛋白的表达量逐渐减少，因此确定1 h为最适诱导时间并进行诱导温度实验。不同温度条件下蛋白诱导实验结果表明(图8: C)，各温度下均有目的蛋白出现，而在30℃下蛋白表达最为丰富，因此确定最佳诱导温度为30℃。目的蛋白在上清液和沉淀中均存在，说明该蛋白以包涵体和溶解性蛋白两种形式共存。

图  7  pET-32a-PaPR10-1 转入BL21( DE3)的条带检测

Figure  7.  Band detection of pET-32a-PaPR10-1 transferred to BL21(DE3)

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图  8  pET-32a-PaPR10-1-BL21( DE3)诱导条件的优化

M：蛋白质分子量标准。A：最佳IPTG诱导浓度的筛选。1：不加IPTG诱导的pET-32a空载体；2：0.5 mmol /L 的 IPTG 诱导pET-32a空载体；3 ~ 7：IPTG诱导浓度分别为 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol /L。B：最佳诱导时间的筛选。1：0.2 mmol /L IPTG 诱导pET-32a 空载体 4 h；2：不加IPTG诱导的pET-32a空载体；3：不加IPTG诱导的菌液; 4 ~ 8：0.2 mmol /L的IPTG分别诱导 1、2、3、4、5 h。C：最佳诱导温度的筛选。1：诱导全菌液；2 ~ 5：分别以 20℃、25℃、30℃和 37℃诱导上清中的蛋白表达；6 ~ 9：分别以20℃、25℃、30℃和 37℃诱导沉淀中的蛋白表达。

Figure  8.  Optimization of induction conditions of pET-32a-PaPR10-1-BL21(DE3)

M: Protein marker. A: Screening of optimal IPTG-induced concentration. 1: pET-32a empty vector without IPTG; 2: IPTG (0.5 mmol/L)-induced pET-32a empty vector; 3–7: pET-32a-PICHI-BL21(DE3) was induced by 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mmol/L IPTG. B: Screening of optimal induction time. 1: IPTG (0.2 mmol/L)-induced pET-32a empty vector; 2: pET-32a empty vector without IPTG; 3: pET-32a-PICHI-BL21(DE3) without IPTG; 4–8: pET-32a-PICHI-BL21(DE3) was induced by IPTG (0.2 mmol/L) in 1, 2, 3, 4, 5 h. C: Screening of optimal induction temperature. 1: pET-32a-PICHI-BL21(DE3) was induced at 37℃; 2–5: Supernatant of pET-32a-PICHI-BL21(DE3) was induced at 20℃, 25℃, 30℃, and 37℃; 6–9: Precipitation of pET-32a-PICHI-BL21(DE3) was induced at 20℃, 25℃, 30℃, and 37℃.

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2.8   PaPR10-1蛋白纯化及RNase活性检测

根据His标签蛋白纯化试剂盒的说明书对PaPR10-1蛋白进行纯化(图9：A)，对纯化后的PaPR10-1蛋白的RNase活性进行分析 (图9：B)，发现DEPC水、洗脱液、RNA酶清除剂等对底物降解作用不明显，纯化蛋白对底物降解作用明显，而纯化蛋白加入核酸酶抑制剂后抑制了底物的降解，表明纯化后的PaPR10-1蛋白具有体外RNase活性。采用1.6所述方法，测得外源表达的PaPR10-1对酵母tRNA的水解活性(核酸酶活性)为26.6 U/mg。

图  9  PaPR10-1蛋白纯化(A)及RNase活性检测(B)

M：蛋白质分子量标准；a：纯化结果。 1：DEPC水；2：洗脱液；3：RNA酶清除剂 + PaPR10-1蛋白；4：PaPR10-1蛋白；5：RNA酶清除剂。

Figure  9.  Purification of PaPR10-1 protein (A) and detection of ribonuclease activity (B)

M: Protein marker; a: Purification result. B: 1: DEPC water; 2: Eluent; 3: RNase scavenger + PaPR10-1 protein; 4: PaPR10-1 protein; 5: RNase scavenger.

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3.   讨论

本研究首次克隆得到一个响应云杉落针病菌侵染的粗枝云杉PaPR10-1基因，该基因ORF全长486 bp，编码161个氨基酸序列，序列高度保守，无信号肽、不含跨膜区且定位于细胞内，与PR10基因的基本特征相符。对PaPR10-1蛋白进行保守结构域分析可知，该蛋白存在一个完整的Bet_v1-like保守疏水结构域，在该结构域中，包含一个“P-Loop”环和3个保守氨基酸(Lys55、Glu95和Glu150)。研究发现，PR10蛋白中的“P-Loop”结构域包含1个ATP/GTP结合位点的磷酸环，具有三磷酸核苷酶(NTPase)活性，可破坏核苷酸的磷酸基团^{[29, 30]}，可能与RNase活性有关。目前，多种具有“P-Loop”环的植物PR10蛋白的RNase活性被证实，包括岷江百合(Lilium regale Wilson)^[31]、小果野蕉(Musa acuminata Colla)^[32]和蒙古黄芪(Astragalus mongholicus Bunge.)^[33]等。然而，该环的缺失可能会导致PR10蛋白丧失RNase活性，如马铃薯(Solanum tuberosum L.)^[34]和苜蓿( Medicago sativa L.)^[35]。此外，Bet_v1-like结构域中还包括4个重要的保守氨基酸(Lys54、Glu96、Tyr148和Glu150)^[25]，这些氨基酸也可能影响RNase活性，如花生(Arachis hypogaea L.)AhPR10蛋白中的Lys55的缺失导致RNase失活^[36]，豆薯(Pachyrhizus erosus (L.) Urb.)SPE16蛋白中的Glu95A、Glu147A和Tyr149突变明显降低RNase活性^[37]。

Biesiadka等^[38]发现黄羽扇豆(Lupinus luteus L.)PR-10蛋白的晶体结构中，存在一个大型的“Y”型空腔，该空腔被7股β折叠包裹着，能结合细胞分裂素等广泛疏水配体，进而参与植物的代谢调控和生长发育等重要生理进程^[39]，而“P-loop”基序在β2和β3之间。本研究中，生物信息学分析发现PaPR10-1也具有7股β折叠，且β2和β3之间存在保守的“P-loop”基序，但是否形成了“Y”型空腔并发挥相应的生物学功能仍需进一步探索。

高效的蛋白质表达系统对于蛋白质的结构和功能的深入研究十分重要^[40]。外源蛋白质表达常采用大肠杆菌系统，而通过改变诱导条件来提高重组蛋白的可溶性表达量是较为方便快捷且常用的手段。为确定PaPR10-1重组蛋白诱导表达的最佳条件，本研究选取5个浓度梯度IPTG对其进行诱导培养，诱导结果差异不明显，因此最终选用0.2 mmol /L IPTG对PaPR10-1蛋白进行诱导。本研究观察了1 ~ 4 h的诱导时间对重组蛋白的影响，结果显示1 h诱导表达量最高。此外，对PaPR10-1蛋白进行多个温度对比诱导时发现，在30℃和37℃时表达量都较为丰富，这与赵乐等^[41]对丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)SmPR-10-1蛋白最佳温度诱导条件的实验结果相似，但有研究表明37℃条件下易导致重组蛋白积累形成包涵体，而25℃ ~ 30℃易增加重组蛋白的活性和可溶性^[42]，因此本研究选择30℃作为PaPR10-1蛋白诱导的最佳温度。然而本研究中的蛋白电泳分析结果显示，原核表达的蛋白分子量比PaPR10-1蛋白正常大小略大，这可能与pET-32a表达载体本身所带的His-Tag标签序列(约15 kD)有关^[43]。

本研究在响应云杉落针病侵染的粗枝云杉转录组数据中获得一个上调表达的基因PaPR10-1，结合分子克隆方法获得该基因全长cDNA序列，对该基因进行了一系列生物信息学分析和进化树构建，并在优化条件下体外表达和纯化了PaPR10-1蛋白，验证了其核糖核酸酶活性，但该蛋白的抗菌活性及其参与的生物学功能还有待进一步研究。