Analysis of multi-organ full-length transcriptome and structural genes involved in flavonoid biosynthesis of Gymnosphaera podophylla Dalla Torre & Sarnth.
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摘要:
黑桫椤（Gymnosphaera podophylla Dalla Torre & Sarnth.）为著名的孑遗蕨类，具有很强的环境适应能力，然而其适应性机制尚不清楚。本研究采用PacBio和Illumina技术对黑桫椤的根、羽轴和羽片进行转录组测序，分别生成12 879、14 185和16 084个全长unigenes。基因表达分析结果表明，与黑桫椤抗干旱、缺水胁迫和生物胁迫相关的基因表达水平较高。根、羽轴和羽片特异性上调基因均显著富集到KEGG代谢通路中的“苯丙烷生物合成途径”，根和羽轴的器官特异性上调基因还显著富集到“类黄酮生物合成途径”。共有192个全长unigenes被注释为类黄酮生物合成途径所涉及的13个酶结构基因，其中包括112个差异表达基因（DEGs），表明黑桫椤类黄酮生物合成途径较为保守，且存在器官特异性差异表达基因。本文对黑桫椤多器官全长转录组和类黄酮生物合成途径结构基因进行了综合分析，为进一步研究其对环境的适应性提供了丰富的遗传资源。
Abstract:Gymnosphaera podophylla Dalla Torre & Sarnth. is a famous relict tree fern with strong environmental adaptability. However, the mechanisms underlying its adaptability remain unclear. In this study, the PacBio and Illumina platforms were used to sequence the root, rachis, and pinna transcriptomes of G. podophylla, resulting in the generation of 12 879, 14 185, and 16 084 full-length unigenes, respectively. Transcript quantification showed that these unigenes were related to drought resistance and biological stress and were highly expressed. KEGG enrichment analysis indicated that the up-regulated genes in the roots, rachis, and pinna were enriched in the "phenylpropane biosynthesis pathway", while the up-regulated genes in the roots and rachis were enriched in the "flavonoid biosynthetic pathway". A total of 192 full-length unigenes were annotated as structural genes involving 13 enzymes in the flavonoid biosynthesis pathway, including 112 differentially expressed genes (DEGs), suggesting that the flavonoid biosynthesis pathway was conserved in G. podophylla, with organ-specific DEGs. This research is the first to perform a comprehensive analysis of the full-length transcriptome across multiple organs in G. podophylla and to investigate the structural genes of the flavonoid biosynthetic pathway. This study provides an abundance of genetic resources for further examination of environmental adaptation in this species.
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黑桫椤（Gymnosphaera podophylla Dalla Torre & Sarnth.）隶属于桫椤科黑桫椤属，为大型草本蕨类植物[1, 2]。该植物高1~3 m，叶柄、叶轴和羽轴均具棕色鳞片，为国家二级保护植物。作为第四纪冰川孑遗植物，黑桫椤主要生长在低纬度温暖、潮湿和阴凉的栖息地。尽管面临全球气候变暖所引发的高温、干旱和缺水胁迫等问题，黑桫椤群落仍能呈稳定的低增长趋势[3]。
研究发现，生长在环境较差的山坡上的黑桫椤，其叶片总黄酮浓度高于生长在沟底的黑桫椤，且叶片中的总黄酮量高于其复叶柄[4]。类黄酮化合物是植物总黄酮的主要成分，是以2-苯基色原酮为骨架衍生的一类化合物的总称[5]，属植物次生代谢产物。这类化合物在植物遭受胁迫时大量积累，在清除自由基、提高植物对逆境胁迫的耐性和抗性等过程中发挥重要作用[6]。因此，类黄酮化合物的积累可能是黑桫椤应对胁迫的一种策略。
蕨类植物中的类黄酮化合物主要有查尔酮、黄酮以及黄酮醇[7]。目前已在Cyathea delgadii Sternb.的细胞悬浮液中检测出丰富的类黄酮化合物[8]，桫椤（Alsophila spinulosa (Wall. ex Hook.) R. M. Tryon）根、羽轴和羽片的器官特异性上调基因均富集到“类黄酮生物合成”KEGG途径[9]。同时，基于转录组和代谢组学分析，蕨类植物金星蕨科和水龙骨科的类黄酮生物合成途径已被阐述[10, 11]。然而，目前还缺乏对桫椤科植物类黄酮生物合成途径的转录组学分析。
本研究以黑桫椤为研究对象，采用PacBio三代测序技术，分别对根、羽轴和羽片3种器官进行测序。同时，利用Illumina 测序进行校准，以获得高质量的全长转录组数据。本文重点挖掘黑桫椤的类黄酮生物合成基因，旨在为进一步阐明其合成途径奠定基础，也为深入了解树蕨类植物的适应性提供分子资源。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
黑桫椤的根、羽轴和羽片的新鲜样本于2019年5月1日取自海南昌江县霸王岭（海拔884 m，19°4′34′′N，109°8′46"E），将样品洗涤干燥后立即浸入RNA保护液中，−20 ℃保存。使用RNeasy Plus Mini 试剂盒（QIAGEN，Hilden，德国）提取总RNA，分别利用琼脂糖凝胶电泳、Nanodrop、Qubit2.0、Agilent 2100来分析RNA降解程度和纯度、检测OD260/OD280比值、定量RNA浓度及检测RNA完整性。
1.2 实验方法
1.2.1 二代测序（Illumina）和转录本拼接
采用Oligo dT 磁珠富集mRNA，利用 NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit制备 NGS 文库，在NovaSeq 6000 平台进行双端测序。使用Trimmomatic v0.39[12]软件过滤数据，去除包括含接头的reads、N>10%以及低质量reads的原始读数。过滤后的数据用Trinity v2.4.0[13]软件拼接转录本，min_kmer_cov设置为2。组装后的序列采用Corset v1.05[14]软件聚类，获得unigenes。
1.2.2 三代测序（Iso-Seq）和下机数据处理
采用SMARTer PCR cDNA 合成试剂盒将mRNA逆转录成cDNA，并进行PCR扩增。利用BluePippin Size Selection System 富集>4 kb 的 cDNA，不筛选片段和>4 kb片段按1∶1等摩尔混合，构建SMRT bell 文库，在Sequel Ⅱ System SMRT Cell平台上测序。下机数据用SMRT Link v6.0软件处理并polish，获得高质量的polish consensus序列。再利用LoRDEC v0.7[15]软件和二代测序的clean reads对polish consensus进行校正，通过CD-HIT v4.6.8[16]软件去冗余，获得非冗余全长转录本。合并3种器官的全长 unigenes（FL unigenes），同样采用 CD-HIT去冗余，获得3种器官全长转录组的参考序列（ref）。
1.2.3 基因功能与基因结构注释
为获得全面的基因功能信息，使用BLAST v2.7.1 + [17]软件对FL unigenes进行NT数据库注释；使用Diamond v0.8.36[18]软件进行NR、KOG、Swiss-Prot、KEGG数据库的注释；使用HMMER v3.1[19]软件进行Pfam数据库注释；使用pfam2go进行GO数据库注释。
分别使用ANGEL v2.4[20]和MISA v1.0[21]软件预测编码序列（CDS）和简单序列重复（SSR）。植物转录因子则由iTAK v1.7[22]软件预测。采用默认参数，分别通过CNCI v2[23]、CPC v0.9[24]、PfamScan v0.9[25]和PLEK v1.2[26]等4种软件预测LncRNA。交集且长度≥200 bp的被认为是预测准确的LncRNA。
1.2.4 基因表达定量与差异表达基因分析
使用Bowtie2 v2.3.4[27]软件将二代转录本与参考序列（ref）比对，再用RSEM v1.3.0[28]软件定量分析转录本，通过DEGseq v1.12.0[29]软件获得差异表达基因（Differentially expressed genes，DEGs）。以非冗余FL unigenes的GO与KEGG注释为背景文件，使用TBtools v1.098761[30]软件的KEGG enrichment analysis和GO enrichment功能对器官特异性上调基因进行GO和KEGG富集分析，P <0.05的GO term或KEGG通路被选用。
1.2.5 类黄酮生物合成通路分析
基于KEGG注释中的类黄酮生物合成通路（ko00941）基因，结合Swiss-Prot数据库的注释结果，确定与类黄酮生物合成途径相关的结构基因。排除在3种器官中均不表达的基因（FPKM<0.3），采用TBtools v1.098761[30]软件的HeatMap功能，对该通路DEGs的FPKM值作log10（FPKM+1）和Row-Z-Score归一化处理，获得可视化表达谱。
2. 结果与分析
2.1 PacBio测序下机数据处理
根、羽轴和羽片的原始下机数据量（Polymerase reads）分别为16.83、19.11和22.83 G。经过滤获得子序列（Subreads），自我校正后获得CCS序列（Circular consensus read），进一步筛选出全长非嵌合序列（Full-length non-chimeric read，FLNC）。将FLNC序列进行聚类、去冗余、polish等处理，分别得到23 277、25 998和34 588个High-quality polished consensus序列（附表1
1 ）。2.2 全长转录本校正
利用来自相同样本二代测序（Illumina）的clean reads校正polished consensus 序列，根、羽轴和羽片分别产生12 879、14 185和16 084个去冗余的FL unigenes（表1）。N50分别为1 979 、1 898和1 875 bp，GC含量分别为48.0%、47.0%和47.0%。
表 1 全长转录组和组装数据Table 1. Full-length transcriptome and assembled data器官
Organ基因类型
Unigenes type碱基量
Raw reads / Gb总数
Total numberGC含量
GC content / %N50 / bp 根 组装 8.20 35 921 50.00 1838 全长 16.26 12 879 48.00 1979 羽轴 组装 8.81 30 752 49.70 1938 全长 18.39 14 185 47.00 1898 羽片 组装 6.74 29 938 49.30 1804 全长 21.99 16 048 47.00 1875 2.3 全长转录组的功能与结构注释
对FL unigenes用7个公共数据库（Nr、Nt、Pfam、KOG、Swiss-Prot、KEGG、GO）进行基因功能注释。不同器官转录组在相同数据库的注释结果相似，NR数据库的注释率最高，NT数据库的注释率最低。分别有90.39%（根）、90.55%（羽轴）和88.67%（羽片）的FL unigenes至少在1个数据库中得到注释，分别有21.93%（根）、22.71%（羽轴）和20.72%（羽片）的FL unigenes在所有数据库均得到注释（附表2
1 ）。Pfam数据库注释结果表明，“蛋白激酶结构域”和“蛋白酪氨酸激酶”是黑桫椤3种器官转录组中含量最丰富的蛋白质家族。KOG数据库注释到3种器官全长转录组中最多的类别是“主要功能预测（R）”，其次是“次级代谢物生物合成，转运和代谢（O）”和“信号转导机制（T）”（附图1
2 ）。在根、羽轴和羽片的FL unigenes 中，分别预测了LncRNA、SSR、转录因子和CDS（附表3
2 ）。LncRNA与mRNA的平均长度相接近。3种器官中预测的常见SSR类型均为双核苷酸重复，预测到最多的转录因子家族均为Ap2/ERF-ERF，其次是bHLH（附图22 ）。2.4 全长转录组基因表达分析
将二代测序的clean reads映射到非冗余全长转录组，获得FL unigenes的FPKM值（附表4
2 ）。FL unigenes 的FPKM值一般在5~15，在黑桫椤根、羽轴和羽片中分别占30.94%、31.46%和31.83%。FPKM≤0.3的FL unigenes被认为是非表达基因，在后续分析中将被去除。将注释为相同蛋白的FL unigenes 的 FPKM 值相加，确定表达量最高的前10个基因（图1：A）。根、羽轴和羽片中表达水平最高的分别为四旋蛋白8（Tetraspanin-8，TET-8）、脱落应激成熟蛋白2（Abscisic stress-ripening protein 2，ASR2）和18.1 kDaⅠ类热休克蛋白（18.1 kDa class Ⅰ heat shock protein，HS181）基因。HS181在羽轴和羽片均有较高的表达水平，而热休克 70 kDa 蛋白 2（Heat shock 70 kDa protein 2，HSP72）基因则在根中高表达。分析发现，ASR家族的3个成员ASR1、ASR2和ASR3中，ASR3在根中的表达水平相对较低；ASR2在羽轴中的表达水平最高，其次是ASR1；ASR1在羽片中的表达水平也较高。
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图 1 黑桫椤3种器官的高表达和差异表达基因A：各器官前10个高表达基因。柱状图底部的数字代表注释为同一蛋白的FL unigenes数目。柱状图上方的数字代表注释为同一蛋白的FL unigenes的总FPKM值；B：从左至右依次为根和羽轴、羽片和羽轴、羽片和根的成对比较的差异表达基因数量；C：从左至右依次是根、羽轴、羽片相对于其他两种器官上调的基因数量。Figure 1. Highly expressed genes and DEGs in three organs of Gymnosphaera podophyllaA: The top ten highly expressed genes in three organs. Number of FL unigenes annotated as same protein is shown at the bottom of the bar. Sum of FPKM values of FL unigenes annotated for the same protein are above the bar; B: From left to right is the number of DEGs in roots versus rachis, pinna versus rachis, and pinna versus roots, respectively; C: From left to right, number of genes up-regulated in roots, rachis, and pinna relative to the other two organs, respectively.基于器官间的成对比较获得差异表达基因（图1：B）。其中，在根、羽轴和羽片中分别有2 569、1 077和2 019个unigenes，相对其他两个器官上调表达（图1：C）。根的上调基因显著富集到植物激素信号转导（“Plant hormone signal transduction”）、环境信息处理（“Environmental Information Processing”）等KEGG途径。羽轴的上调基因显著富集到代谢（“Metabolism”）、半胱氨酸代谢和蛋氨酸代谢（“Cysteine and methionine metabolism”）等KEGG途径，并显著富集到刺激响应（“Response to stimulus）、胁迫响应（“Response to stress”）等生物过程GO术语。羽片的上调基因显著富集到光合作用蛋白（“Photosynthesis proteins”）、光合作用（“Photosynthesis”）等KEGG途径，并显著富集到磷酸化（“Phosphorylation”）、羧酸代谢过程（“Carboxylic acid metabolic process”）等生物过程相关的GO术语，以及膜（“Membrane）、类囊体（“Thylakoid”）等细胞组分相关的GO术语，这些术语与光合代谢密切相关。根、羽轴和羽片的上调基因均显著富集到苯丙烷生物合成途径（“Phenylpropanoid pathway”），根和羽轴的上调基因还显著富集到类黄酮生物合成途径（“Flavonoid biosynthesis pathway”）（附图3
2 ）。2.5 类黄酮通路表达基因的发掘与差异表达基因分析
在黑桫椤全长转录组中，有192个FL unigenes注释到类黄酮生物合成通路（ko00941）中的13个酶（附表5
2 ）。大多数酶具有较多的FL unigenes成员，但CHI只有2个FL unigenes，LODX仅有1个FL unigene。在构建的类黄酮生物合成通路中（图2），没有发现被注释为黄烷酮3-羟化酶（Flavanone 3-hydroxylase，F3H）和黄酮合酶（Flavone synthase，FNS）的FL unigenes。![]()
图 2 类黄酮生物合成通路热图展示了3种器官中类黄酮生物合成途径的DEG表达情况。高亮表示该酶有多个FL unigenes（>10），标红字体表示未发现FNS和F3H的FL unigenes，虚线箭头表示由多个酶参与的多步反应。Figure 2. Flavonoid biosynthesis pathwayHeatmap showing DEG expression profiles of flavonoid biosynthesis pathway in three organs. Highlighted gene contains multiple unigenes (>10) in G. podophylla. Red font indicates F3H and FNS genes were not found in transcriptome. Dotted arrows indicate multi-step reaction with multiple enzymes.根据|log2(fold change)| >1且 q value<0.005的标准，在类黄酮生物合成通路中鉴定出112个DEGs（图2）。其中，GpPAL-4（HQ_AP3_Pinna/f2p0/2322）仅在羽片中表达，而GpPAL-3（HQ_AP3_Pinna_9583/f2p0/1709）和GpPAL-4（HQ_AP3_Pinna_3853/f2p0/2322）在根中均不表达。Gp4CL-10（HQ_AP3_Roots/f5p0/2317）和Gp4CL-3（HQ_AP3_Pinna/f2p0/2418）在根中上调表达，导致4CL在根的总体表达水平明显高于其他两种器官。GpC4H-14（HQ_AP3_Rachis/f13p0/1830）在羽轴中特异性上调表达（FPKM=1 817.42）。GpCHI-1（HQ_AP3_Rachis/f3p0/976）仅在羽轴上调表达，而GpCHI-2（HQ_AP3_Pinna /f6p0/969）在羽轴和根中均上调表达。CCOAOMT的 DEGs大部分在羽片中上调表达，但在根中下调表达。F3′H和F3′5′H的大部分成员在羽轴中均上调表达。
3. 讨论
3.1 黑桫椤多器官全长转录组的高表达基因和器官特异性DEGs
本研究分别从黑桫椤的根、羽轴和羽片中获得了12 879、14 185、16 084个FL unigenes，得到注释的基因分别占90.39%，91.55%和88.67%，表明全长转录组的注释信息非常丰富。基因表达定量分析发现，编码四旋蛋白-8的基因（TET-8）仅在根中高水平表达。含TET-8的植物细胞外囊泡可通过靶向毒力基因抑制真菌的致病性，如灰霉病菌、致病疫酶菌等[31-33]。由此推测，黑桫椤根部可通过TET-8基因的高表达抵御生物胁迫。ASR2是黑桫椤羽轴中具有较高表达水平的基因。在缺水胁迫时，ASR2在番茄（Solanum lycopersicum L.）的叶子和根中上调表达[34, 35]。桫椤有10个ASR基因，包括ASR1、ASR2和ASR5等3个基因家族，均具有ABA-缺水胁迫基序[35]。本研究在黑桫椤转录组中鉴定出了ASR1、ASR2和ASR3，但没有发现ASR5。在黑桫椤羽片中表达水平最高的ASR基因家族成员是ASR1，该基因的表达水平与非生物胁迫反应直接相关，其过量表达可增强番茄对干旱胁迫的耐受性[36]。羽片中高表达的基因为HS181，这是一种受热应激或高光胁迫会高度表达的小热激蛋白（smHSPs）[37]。羽片是最易受到光胁迫和高温胁迫的部位，同时又是光合作用的重要场所，HS181的上调表达有助于黑桫椤羽片细胞抵御热胁迫造成的损伤，如ROS积累和蛋白质错误折叠，并帮助黑桫椤在遭遇干旱胁迫后快速恢复。总之，3种器官的高表达基因均富含抗逆相关的基因，为进一步研究黑桫椤的适应性进化机制提供了参考。
黑桫椤根部的上调表达基因最多，其次是羽片，羽轴的上调表达基因数量最少。树蕨根部更易受生物和非生物胁迫，导致其具有更多特异性上调表达的基因[9]。黑桫椤根部的上调基因显著富集到与植物激素信号转导、转录因子等与环境适应相关的KEGG途径，特别是富集到MAPK信号通路。该通路能与乙烯、生长素、茉莉酸、脱落酸等多种信号途径相互作用，调控下游特定转录因子，并与植物生长发育和逆境应答密切相关[38]。树蕨类植物是仅存的具有木质茎的孑遗蕨类，茎干的次生壁部分沉积大量木质素的管胞[39]。黑桫椤羽轴的上调表达基因显著富集到苯丙烷生物合成途径，这可能与羽轴木质素生物合成十分活跃有关。羽片的上调表达基因主要富集到与光合代谢相关的KEGG途径和GO术语，与其参与光合代谢的功能相一致。
3.2 黑桫椤类黄酮生物合成通路中的基因成员和DEGs
由PAL、C4H和4CL催化生成对香豆酸辅酶A的途径被称为公共苯丙烷途径（General phenylpropanoid pathway）[5]。该途径为下游类黄酮生物合成分支提供前体。目前发现，桫椤中存在21个AspiPAL成员、10个AspiC4H成员和48个Aspi4CL成员[39]，而在黑桫椤转录组中对应地分别有11、37和33个FL unigenes。鉴于苯丙烷代谢具有多个分支途径，多个unigenes成员的存在可能与黑桫椤调控这些分支途径有关。
PAL引导莽草酸途径产物到苯丙烷生物合成途径及其分支途径，控制着初级代谢物向次级代谢物的转化，是苯丙烷途径的第一个限速酶[40]。C4H的蛋白质活性和转录丰度能直接影响苯丙烷生物合成途径中的多个分支途径[5]。GpC4H-14在黑桫椤羽轴中上调表达，是所有C4H unigenes成员中表达量最高的，也是整个类黄酮通路中表达水平最高的，可能是黑桫椤羽轴类黄酮生物合成和木质素生物合成中的关键调控基因。
CHS是类黄酮途径中的第一个限速酶[41]，黑桫椤中有37位成员。CHS的总FPKM值在羽轴最高（5 207.72），其次是根（4 116.66）和羽片（2 450.44），说明由CHS控制的苯丙烷分支转向类黄酮分支非常活跃，特别是在羽轴和根部。和桫椤一样[39]，PAL、C4H、4CL、CHS等基因家族可能在黑桫椤基因组中发生了基因重复。但本研究分析的是转录组数据，因此这种结果也可能是由可变剪切等原因所造成的。CHS催化生成各类查尔酮，在环境胁迫与生物胁迫下被普遍诱导[42]。以咖啡酰辅酶A和阿魏酰辅酶A为偏好底物的CHS被紫外线和病原体诱导，生成多羟基和甲氧基取代的查尔酮，以响应胁迫[43-45]。CCoAOMT的DEGs主要在黑桫椤羽片中上调表达，可能有助于O-甲基化查尔酮的生成。
CHI催化查尔酮生成黄烷酮[46]，并在F3H、F3′H、F3′5′H等酶的催化下生成二氢黄酮醇。本研究中没有发现F3H基因，但发现了柚皮素-3-羟化酶/黄酮醇合成酶（Naringenin 3-dioxygenase/Flavonol synthase，FLS）基因。F3H、FLS 均为2OGD超家族（2-Oxoglutarate-dependent dioxygenase family）DOXC类成员。研究表明，FLS由F3H进化而来，具有补充F3H功能的作用[47, 48]。
二氢黄酮醇可在FLS催化下生成黄酮醇，或在DFR催化下生成无色花青素[49]，无色花青素在LDOX催化下生成有色花青素。光是影响花青素积累的重要环境因素之一，黑桫椤虽然分布在低纬度地区，但生长在温暖、湿润、阴蔽的环境，光照受到影响，可导致有色花青素的含量下降。本研究鉴定出13个DFR成员和1个LDOX成员，GpLDOX（HQ_AP3_Rachis_10323/f2p0/1520）在羽片中的FPKM值仅为3.41，转录丰度和表达水平都不高。陈雪菲等[50]检测到小黑桫椤（Gymnosphaera metteniana（Hance）Tagawa）植物叶片中有色花青素含量为49.1 mg/kg，总黄酮为48.93 mg/g，原花青素含量为38.42 mg/g。据此推测，黑桫椤中由DFR催化生成的无色花青素可能参与了原花青素的形成；其类黄酮种类主要是查尔酮和黄酮醇。在干旱条件下，花青素会抑制气孔关闭，降低植物的抗旱能力，而黄酮醇则能通过清除过量ROS、增强对渗透胁迫的耐受性、调节气孔关闭、降低失水率等方式提高植物的抗旱能力[51]。此外，黄酮醇还在调节和转运生长素、抵抗真菌等病原体中发挥重要作用[49, 52]。F3′H、F3′5′H在黑桫椤羽片中上调表达，可能有利于槲皮素、杨梅素等黄酮醇的积累，这些类黄酮化合物在黑桫椤适应环境过程中发挥着重要作用。
4. 结论
本研究通过PacBio和Illumina测序技术，分析了黑桫椤根、羽轴和羽片的全长转录组，从中分别鉴定出12 879、14 185、16 084个FL unigenes，并对其进行了功能注释。定量表达分析表明，黑桫椤各器官中的高表达基因与胁迫抵御相关。此外，本文还构建了黑桫椤的类黄酮生物合成通路，并阐述了该通路结构基因的表达情况。这些结果为进一步研究黑桫椤的适应性进化机制提供了分子资源，也为树蕨类植物的其他研究提供了全长转录组遗传资源。
致谢：感谢中山大学生命科学学院洪永峰、何梓卿在材料采集中提供的帮助！
1 如需查阅附表内容请登录《植物科学学报》网站（http://www.plantscience.cn）查看本期文章。2 1~7）如需查阅附件内容请登录《植物科学学报》网站（http://www.plantscience.cn）查看本期文章。 -
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图 1 黑桫椤3种器官的高表达和差异表达基因
A：各器官前10个高表达基因。柱状图底部的数字代表注释为同一蛋白的FL unigenes数目。柱状图上方的数字代表注释为同一蛋白的FL unigenes的总FPKM值；B：从左至右依次为根和羽轴、羽片和羽轴、羽片和根的成对比较的差异表达基因数量；C：从左至右依次是根、羽轴、羽片相对于其他两种器官上调的基因数量。
Figure 1. Highly expressed genes and DEGs in three organs of Gymnosphaera podophylla
A: The top ten highly expressed genes in three organs. Number of FL unigenes annotated as same protein is shown at the bottom of the bar. Sum of FPKM values of FL unigenes annotated for the same protein are above the bar; B: From left to right is the number of DEGs in roots versus rachis, pinna versus rachis, and pinna versus roots, respectively; C: From left to right, number of genes up-regulated in roots, rachis, and pinna relative to the other two organs, respectively.
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图 2 类黄酮生物合成通路
热图展示了3种器官中类黄酮生物合成途径的DEG表达情况。高亮表示该酶有多个FL unigenes（>10），标红字体表示未发现FNS和F3H的FL unigenes，虚线箭头表示由多个酶参与的多步反应。
Figure 2. Flavonoid biosynthesis pathway
Heatmap showing DEG expression profiles of flavonoid biosynthesis pathway in three organs. Highlighted gene contains multiple unigenes (>10) in G. podophylla. Red font indicates F3H and FNS genes were not found in transcriptome. Dotted arrows indicate multi-step reaction with multiple enzymes.
表 1 全长转录组和组装数据
Table 1 Full-length transcriptome and assembled data
器官
Organ基因类型
Unigenes type碱基量
Raw reads / Gb总数
Total numberGC含量
GC content / %N50 / bp 根 组装 8.20 35 921 50.00 1838 全长 16.26 12 879 48.00 1979 羽轴 组装 8.81 30 752 49.70 1938 全长 18.39 14 185 47.00 1898 羽片 组装 6.74 29 938 49.30 1804 全长 21.99 16 048 47.00 1875 
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[1] 苏应娟,王艇,郑博,江宇,欧阳蒲月,等. 根据cpDNA trnL-F非编码区序列变异分析黑桫椤海南和广东种群的遗传结构与系统地理[J]. 生态学报,2004,24(5):914−919. doi: 10.3321/j.issn:1000-0933.2004.05.008 Su YJ,Wang T,Zheng B,Jiang Y,Ouyang PY,et al. Genetic structure and phylogeography of populations of Alsophila podophylla in Hainan and Guangdong,southern China,based on cpDNA trnL-F noncoding sequences[J]. Acta Ecologica Sinica,2004,24(5):914−919. doi: 10.3321/j.issn:1000-0933.2004.05.008
[2] Ppg I. A community-derived classification for extant lycophytes and ferns[J]. J Syst Evol,2016,54(6):563−603. doi: 10.1111/jse.12229
[3] 谢春平,赵柏松,刘大伟,方彦. 霸王岭自然保护区黑桫椤种群结构特征分析[J]. 四川农业大学学报,2018,36(6):765−771. Xie CP,Zhao BS,Liu DW,Fang Y. Study on the population structure of Alsophila podophylla Hook. in Bawangling nature reserve[J]. Journal of Sichuan Agricultural University,2018,36(6):765−771.
[4] 赵则海. 黑桫椤叶中总黄酮含量的测定[J]. 肇庆学院学报,2014,35(5):42−44. doi: 10.3969/j.issn.1009-8445.2014.05.011 Zhao ZH. Determination of flavonoids contents in leaves of Alsophila podophylla[J]. Journal of Zhaoqing University,2014,35(5):42−44. doi: 10.3969/j.issn.1009-8445.2014.05.011
[5] Dong NQ,Lin HX. Contribution of phenylpropanoid metabolism to plant development and plant-environment interactions[J]. J Integr Plant Biol,2021,63(1):180−209. doi: 10.1111/jipb.13054
[6] 葛诗蓓,张学宁,韩文炎,李青云,李鑫. 植物类黄酮的生物合成及其抗逆作用机制研究进展[J]. 园艺学报,2023,50(1):209−224. Ge SB,Zhang XN,Han WY,Li QY,Li X. Research progress on plant flavonoids biosynthesis and their anti-stress mechanism[J]. Acta Horticulturae Sinica,2023,50(1):209−224.
[7] Zhang XX,Wang X,Wang ML,Cao JG,Xiao JB,Wang QX. Effects of different pretreatments on flavonoids and antioxidant activity of Dryopteris erythrosora leave[J]. PLoS One,2019,14(1):e0200174. doi: 10.1371/journal.pone.0200174
[8] Rybczyński JJ,Marczak Ł,Stobiecki M,Strugała A,Mikuła A. The metabolite content of the post-culture medium of the tree fern Cyathea delgadii Sternb. cell suspension cultured in the presence of 2,4-D and BAP[J]. Int J Mol Sci,2022,23(19):11783. doi: 10.3390/ijms231911783
[9] Hong YF,Wang Z,Li MH,Su YJ,Wang T. First multi-organ full-length transcriptome of tree fern Alsophila spinulosa highlights the stress-resistant and light-adapted genes[J]. Front Genet,2022,12:784546. doi: 10.3389/fgene.2021.784546
[10] Sun MY,Li JY,Li D,Huang FJ,Wang D,et al. Full-length transcriptome sequencing and modular organization analysis of the naringin/neoeriocitrin-related gene expression pattern in Drynaria roosii[J]. Plant Cell Physiol,2018,59(7):1398−1414.
[11] Niu M,Fu J,Ni R,Xiong RL,Zhu TT,et al. Functional and structural investigation of chalcone synthases based on integrated metabolomics and transcriptome analysis on flavonoids and anthocyanins biosynthesis of the fern Cyclosorus parasiticus[J]. Front Plant Sci,2021,12:757516. doi: 10.3389/fpls.2021.757516
[12] Bolger AM,Lohse M,Usadel B. Trimmomatic:a flexible trimmer for Illumina sequence data[J]. Bioinformatics,2014,30(15):2114−2120. doi: 10.1093/bioinformatics/btu170
[13] Grabherr MG,Haas BJ,Yassour M,Levin JZ,Thompson DA,et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome[J]. Nat Biotechnol,2011,29(7):644−652. doi: 10.1038/nbt.1883
[14] Davidson NM,Oshlack A. Corset:enabling differential gene expression analysis for de novo assembled transcriptomes[J]. Genome Biol,2014,15(7):410.
[15] Salmela L,Rivals E. LoRDEC:accurate and efficient long read error correction[J]. Bioinformatics,2014,30(24):3506−3514. doi: 10.1093/bioinformatics/btu538
[16] Fu LM,Niu BF,Zhu ZW,Wu ST,Li WZ. CD-HIT:accelerated for clustering the next-generation sequencing data[J]. Bioinformatics,2012,28(23):3150−3152. doi: 10.1093/bioinformatics/bts565
[17] Altschul SF,Gish W,Miller W,Myers EW,Lipman DJ. Basic local alignment search tool[J]. J Mol Biol,1990,215(3):403−410. doi: 10.1016/S0022-2836(05)80360-2
[18] Buchfink B,Xie C,Huson DH. Fast and sensitive protein alignment using DIAMOND[J]. Nat Methods,2015,12(1):59−60. doi: 10.1038/nmeth.3176
[19] Finn RD,Clements J,Eddy SR. HMMER web server:interactive sequence similarity searching[J]. Nucleic Acids Res,2011,39(S2):W29−W37.
[20] Shimizu K,Adachi J,Muraoka Y. ANGLE:a sequencing errors resistant program for predicting protein coding regions in unfinished cDNA[J]. J Bioinform Comput Biol,2006,4(3):649−664. doi: 10.1142/S0219720006002260
[21] Beier S,Thiel T,Münch T,Scholz U,Mascher M. MISA-web:a web server for microsatellite prediction[J]. Bioinformatics,2017,33(16):2583−2585. doi: 10.1093/bioinformatics/btx198
[22] Zheng Y,Jiao C,Sun HH,Rosli HG,Pombo MA,et al. iTAK:a program for genome-wide prediction and classification of plant transcription factors,transcriptional regulators,and protein kinases[J]. Mol Plant,2016,9(12):1667−1670. doi: 10.1016/j.molp.2016.09.014
[23] Sun L,Luo HT,Bu DC,Zhao GG,Yu KT,et al. Utilizing sequence intrinsic composition to classify protein-coding and long non-coding transcripts[J]. Nucleic Acids Res,2013,41(17):e166. doi: 10.1093/nar/gkt646
[24] Kong L,Zhang Y,Ye ZQ,Liu XQ,Zhao SQ,et al. CPC:assess the protein-coding potential of transcripts using sequence features and support vector machine[J]. Nucleic Acids Res,2007,35(S2):W345−W349.
[25] Finn RD,Coggill P,Eberhardt RY,Eddy SR,Mistry J,et al. The Pfam protein families database:towards a more sustainable future[J]. Nucleic Acids Res,2016,44(D1):D279−D285. doi: 10.1093/nar/gkv1344
[26] Li AM,Zhang JY,Zhou ZY. PLEK:a tool for predicting long non-coding RNAs and messenger RNAs based on an improved k-mer scheme[J]. BMC Bioinformatics,2014,15(1):311. doi: 10.1186/1471-2105-15-311
[27] Langmead B,Salzberg SL. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2[J]. Nat Methods,2012,9(4):357−359. doi: 10.1038/nmeth.1923
[28] Li B,Dewey CN. RSEM:accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome[J]. BMC Bioinformatics,2011,12:323. doi: 10.1186/1471-2105-12-323
[29] Anders S,Huber W. Differential expression analysis for sequence count data[J]. Genome Biol,2010,11(10):R106. doi: 10.1186/gb-2010-11-10-r106
[30] Chen CJ,Chen H,Zhang Y,Thomas HR,Frank MH,et al. TBtools:an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data[J]. Mol Plant,2020,13(8):1194−1202. doi: 10.1016/j.molp.2020.06.009
[31] Guo L,Qi YT,Mu Y,Zhou J,Lu WH,Tian ZD. Potato StLecRK-Ⅳ. 1 negatively regulates late blight resistance by affecting the stability of a positive regulator StTET8[J]. Hortic Res,2022,9:uhac010.
[32] Li JJ,Li Y,Yin ZG,Jiang JH,Zhang MH,et al. OsASR5 enhances drought tolerance through a stomatal closure pathway associated with ABA and H2O2 signalling in rice[J]. Plant Biotechnol J,2017,15(2):183−196. doi: 10.1111/pbi.12601
[33] Rutter BD,Innes RW. Extracellular vesicles isolated from the leaf apoplast carry stress-response proteins[J]. Plant Physiol,2017,173(1):728−741. doi: 10.1104/pp.16.01253
[34] Maskin L,Gudesblat GE,Moreno JE,Carrari FO,Frankel N,et al. Differential expression of the members of the Asr gene family in tomato (Lycopersicon esculentum)[J]. Plant Sci,2001,161(4):739−746. doi: 10.1016/S0168-9452(01)00464-2
[35] Dominguez PG,Conti G,Duffy T,Insani M,Alseekh S,et al. Multiomics analyses reveal the roles of the ASR1 transcription factor in tomato fruits[J]. J Exp Bot,2021,72(18):6490−6509. doi: 10.1093/jxb/erab269
[36] Golan I,Dominguez PG,Konrad Z,Shkolnik-Inbar D,Carrari F,Bar-Zvi D. Tomato ABSCISIC ACID STRESS RIPENING (ASR) gene family revisited[J]. PLoS One,2014,9(10):e107117. doi: 10.1371/journal.pone.0107117
[37] Ritenour MA,Kochhar S,Schrader LE,Hsu TP,Ku MSB. Characterization of heat shock protein expression in apple peel under field and laboratory conditions[J]. J Am Soc Hortic Sci,2001,126(5):564−570. doi: 10.21273/JASHS.126.5.564
[38] 尹兵兵,潘凌云,付畅. 逆境下植物MAPK级联途径基因的表达调控[J]. 分子植物育种,2022,20(10):3257−3265. Yin BB,Pan LY,Fu C. Regulation of gene expression of plant MAPK cascade pathway under environmental[J]. Molecular Plant Breeding,2022,20(10):3257−3265.
[39] Huang X,Wang WL,Gong T,Wickell D,Kuo LY,et al. The flying spider-monkey tree fern genome provides insights into fern evolution and arborescence[J]. Nat Plants,2022,8(5):500−512. doi: 10.1038/s41477-022-01146-6
[40] Wanner LA,Li GQ,Ware D,Somssich IE,Davis KR. The phenylalanine ammonia-lyase gene family in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Mol Biol,1995,27(2):327−338. doi: 10.1007/BF00020187
[41] Shirley BW,Kubasek WL,Storz G,Bruggemann E,Koornneef M,et al. Analysis of Arabidopsis mutants deficient in flavonoid biosynthesis[J]. Plant J,1995,8(5):659−671. doi: 10.1046/j.1365-313X.1995.08050659.x
[42] Ni R,Niu M,Fu J,Tan H,Zhu TT,et al. Molecular and structural characterization of a promiscuous chalcone synthase from the fern species Stenoloma chusanum[J]. J Integr Plant Biol,2022,64(10):1935−1951. doi: 10.1111/jipb.13335
[43] 林江波,王伟英,邹晖,戴艺民. 基于转录组测序的铁皮石斛黄酮代谢途径及相关基因解析[J]. 福建农业学报,2019,34(9):1019−1025. Lin JB,Wang WY,Zou H,Dai YM. Transcriptome analysis on pathway of and genes Related to flavonoid synthesis in Dendrobium officinale[J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences,2019,34(9):1019−1025.
[44] Christensen AB,Gregersen PL,Schröder J,Collinge DB. A chalcone synthase with an unusual substrate preference is expressed in barley leaves in response to UV light and pathogen attack[J]. Plant Mol Biol,1998,37(5):849−857. doi: 10.1023/A:1006031822141
[45] Rudrapal M,Khan J,Dukhyil AAB,Alarousy RMII,Attah EI,et al. Chalcone scaffolds,bioprecursors of flavonoids:chemistry,bioactivities,and pharmacokinetics[J]. Molecules,2021,26(23):7177. doi: 10.3390/molecules26237177
[46] Van Tunen AJ,Mur LA,Recourt K,Gerats AG,Mol JN. Regulation and manipulation of flavonoid gene expression in anthers of petunia:the molecular basis of the Po mutation[J]. Plant Cell,1991,3(1):39−48.
[47] Yonekura-Sakakibara K,Higashi Y,Nakabayashi R. The origin and evolution of plant flavonoid metabolism[J]. Front Plant Sci,2019,10:943. doi: 10.3389/fpls.2019.00943
[48] Owens DK,Alerding AB,Crosby KC,Bandara AB,Westwood JH,Winkel BSJ. Functional analysis of a predicted flavonol synthase gene family in Arabidopsis[J]. Plant Physiol,2008,147(3):1046−1061. doi: 10.1104/pp.108.117457
[49] Sudheeran PK,Ovadia R,Galsarker O,Maoz I,Sela N,et al. Glycosylated flavonoids:fruit′s concealed antifungal arsenal[J]. New Phytol,2020,225(4):1788−1798. doi: 10.1111/nph.16251
[50] 陈雪菲,张映雪,黄贤燕,王全喜,曹建国,王幼芳. 蕨类植物花青素和原花青素成分及含量分析[J]. 植物科学学报,2020,38(6):820−830. doi: 10.11913/PSJ.2095-0837.2020.60820 Chen XF,Zhang YX,Huang XY,Wang QX,Cao JG,Wang YF. Composition and content analysis of anthocyanidins and proanthocyanidins in ferns[J]. Plant Science Journal,2020,38(6):820−830. doi: 10.11913/PSJ.2095-0837.2020.60820
[51] 肖珍. 黄酮醇和花青素在植物抗逆中的功能差异研究[D]. 济南: 山东大学, 2018: 1-20. [52] Taylor LP,Grotewold E. Flavonoids as developmental regulators[J]. Curr Opin Plant Biol,2005,8(3):317−323. doi: 10.1016/j.pbi.2005.03.005
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