Genetic diversity and genetic structure analysis of wild Chinese Rosa roxburghii Tratt. germplasm resources
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摘要:
基于10对EST-SSR引物，对中国8个省29个居群的261份野生刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）进行毛细管电泳检测，探究其遗传多样性，并进行聚类分析。结果显示，共扩增出了95个等位基因，位点多态性信息含量（PIC）平均值为0.568；群体水平上，平均等位基因数（NA）和有效等位基因数（NE）分别为3.131和2.331，平均观测杂合度（HO）和预期杂合度（HE）分别为0.508和0.488，平均Shannon’s信息指数（I）为0.858，表明野生刺梨种质具有较高的遗传多样性水平。群体遗传分化分析结果显示，平均遗传分化系数（FST）为0.067，基因流（Nm）为4.511，说明刺梨群体间基因流动较频繁。分子方差分析（AMOVA）结果表明刺梨的遗传变异主要来源于居群内（93.64%）。各居群间的Nei氏标准遗传距离范围为0.054~1.269，平均值为0.657，与地理距离表现为显著相关（r=0.467，P<0.000 1）。聚类分析和PCA结果均将29个居群分为3个分支。研究结果说明中国野生刺梨资源核心分布区在我国西南地区。
Abstract:This study explored the genetic diversity and structure of 261 wild Rosa roxburghii Tratt. samples from 29 populations across eight provinces in China, utilizing 10 pairs of polymorphic EST-SSR primers and capillary electrophoresis, providing a clear genetic background for the collection and breeding of R. roxburghii germplasm resources. Results identified 95 alleles among the 261 germplasm materials. The average polymorphism information content of the loci was 0.568. At the population level, the average number of alleles and effective number of alleles were 3.131 and 2.331, respectively, with observed heterozygosity and expected heterozygosity averaging 0.508 and 0.488. The average Shannon’s information index was 0.858, indicating substantial genetic diversity, likely due to the extensive range of sampling sites. Analysis of population genetic differentiation revealed an average genetic differentiation coefficient of 0.067 and gene flow of 4.511, suggesting considerable inter-population gene flow. Analysis of molecular variance (AMOVA) indicated that most genetic variation in R. roxburghii came from within populations (r=0.467, P<0.000 1). Nei’s standard genetic distance among populations ranged from 0.054 to 1.269, with an average of 0.657, and was significantly related to geographical distance. Clustering analysis grouped the 29 populations into three main clusters, which was related to geographical location. These results highlight southwestern China as a core distribution area for wild R. roxburghii resources, providing theoretical guidance for the formulation of R. roxburghii conservation strategies.
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Keywords:
- Rosa roxburghii /
- SSR primers /
- Genetic diversity /
- Genetic structure
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箭叶淫羊藿（Epimedium sagittatum (Sieb. et zucc.) Maxim.）为小檗科淫羊藿属（Epimedium）多年生草本植物，属于药食同源植物。淫羊藿始载于《神农本草经》，在中国已有2 000多年的应用历史，是我国应用最广泛、最古老的药材之一[1]。淫羊藿化学成分丰富，不仅有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效，还具有抗衰老、增强免疫、抑制肿瘤等功能，因此也是最有开发潜力的中药材之一[2, 3]。但淫羊藿也存在种子休眠、发芽困难、繁殖系数低等问题，与中药市场不断增长的需求相矛盾，长期以来，造成了野生资源的严重减少[4, 5]。因此，人工栽培淫羊藿的需求日益增长。Yang等[6]对来自中国30个省、自治区、直辖市的样本进行了重金属含量测定，发现淫羊藿叶片中重金属含量差异较大，铜（Cu）和铅（Pb）是污染该植物最主要的重金属。
硒（Se）是人类和动物必需的14种微量元素之一[7]。1973年，世界卫生组织将硒正式列为人体必需的微量元素之一[8]。1988年，中国营养学会将硒列为每日膳食营养素，建议硒摄入量为50 μg/d[9]。日常摄入硒元素有助于增强免疫力、预防癌症、清除自由基等[10-13]。硒元素能够通过上调一系列抗氧化酶的活性，增加黄酮类、多酚类、抗坏血酸等低分子量物质的浓度，减少重金属在植物中的累积[14-18]。低浓度的硒还可以促进植物生长[19-21]。
富硒栽培技术目前已经涉及到粮食、水果、蔬菜及中药材等多个领域，而对淫羊藿的富硒研究很有限。本文比较了两种不同施硒方式下箭叶淫羊藿吸收有害元素铅、镉（Cd）、汞（Hg）、砷（As）的差异，并采用叶面喷施方式，分析了不同浓度硒处理下植物中总黄酮、淫羊藿苷和朝藿定A、B、C的含量变化，研究结果旨在为箭叶淫羊藿资源的进一步开发和利用提供参考。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
箭叶淫羊藿植物材料由中国科学院武汉植物园提供，均为一年生实生幼苗，具2~3个叶片。亚硒酸钠购自阿法埃莎（中国）化学有限公司；淫羊藿苷、朝藿定A、B、C对照品购自成都普斯生物技术有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 富硒栽培
土壤硒肥的配制：参照本实验室的富硒MS培养液配制方法[22]，配制硒浓度分别为0、10、20、30、40、50 mg/kg的MS营养液，再将浓度为15 mg/kg的铅、汞、镉、砷等依次加入富硒培养液中，按照3∶7的质量比与蛭石混合，即制得淫羊藿幼苗栽培培养基。
叶面硒肥的配制：MS培养液直接与蛭石按比例混合成营养土。配制浓度为0.5 mg/mL的亚硒酸钠母液，同时设置5个剂量，即10、20、30、40、50 mg/kg，以纯净水作为对照。将箭叶淫羊藿幼苗栽培在营养土中，控制湿度为75%，纯净水补充水分，自然光照，缓冲生长30 d，每周叶面喷施1次亚硒酸钠溶液，对照组喷施等量的清水，生长90 d后收获，去掉叶柄，65 ℃烘干后计算单株叶片干重，然后粉碎，过40目筛，保存备用。
1.2.2 有害元素及硒含量的测定
箭叶淫羊藿中的有害元素由湖北省农科院农产品质量检验所分析，方法参照标准为GB/T
17134 -1997。硒含量的测定均采用GB 5009.93-2017中氢化物原子荧光光谱法，由湖北琪谱检测技术有限公司进行分析。1.2.3 总黄酮标准曲线的绘制及含量测定
标准曲线的绘制：以淫羊藿苷对照品，参照《中国药典》2020版的方法[23]，配制标准溶液，以甲醇作空白对照，采用紫外可见分光光度计在270 nm处测定吸光度。以吸光度Y对淫羊藿苷浓度X（μg/mL）进行线性回归，得线性回归方程Y=0.375 1X+0.028 7，r2=0.999 9。
总黄酮含量测定：精确称取5份箭叶淫羊藿粗粉，每份200 mg，分别加入70%乙醇20 mL，超声提取30 min，取滤液0.5 mL，定容至50 mL。以甲醇为对照，在270 nm处测定吸光度，并根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。
1.2.4 淫羊藿苷及朝藿定A、B、C含量测定
液相色谱条件：Agilent ZORBAX TC-C18色谱柱（5 μm，4.6×250 mm，美国）；流动相A为乙酸（0.5%），B为乙腈，梯度洗脱（0~30 min 25%B；30~40 min 100%B；40~50 min 25%B）；流速1 mL/min；柱温30 ℃；进样量5 μL；检测波长272 nm。
对照品溶液的制备：精确称取朝霍定A、朝霍定B、朝霍定C和淫羊藿苷对照品各5 mg，用70%乙醇配制成1 mg/mL的母液，以此为对照品绘制标准曲线。以此标准曲线计算样品中朝霍定A、朝霍定B、朝霍定C和淫羊藿苷的含量。
1.3 数据处理
采用Excel 2020和SPSS 24.0软件进行数据分析和作图，结果以平均值±标准差表示。
2. 结果与分析
2.1 不同施硒肥方式对箭叶淫羊藿有害元素吸收的影响
土壤施硒处理下，箭叶淫羊藿对有害元素的吸收如图1所示。与对照组相比，10 mg/kg处理组叶片中4种有害元素的含量明显降低，说明土壤中较低浓度的硒可以抑制箭叶淫羊藿对有害元素的吸收。随着土壤中硒浓度的上升，箭叶淫羊藿对Pb、Hg、Cd的吸收呈上升趋势，而对As的吸收先升后降，表明高浓度的硒可促进箭叶淫羊藿对有害元素的吸收，特别是对Cd吸收的促进最强，其次是Pb和Hg。
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图 1 土壤施硒肥下箭叶淫羊藿叶片中有害元素的含量Figure 1. Harmful element content in Epimedium sagittatum leaves following selenium soil cultivation叶面施硒对箭叶淫羊藿吸收有害元素的影响如图2所示。4种元素的含量均随硒浓度的增加呈下降趋势。其中，对Cd的抑制效应尤为明显，其次是As、Pb、Hg。
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图 2 叶面施硒肥下箭叶淫羊藿叶片中有害元素的含量Figure 2. Harmful element content in Epimedium sagittatum leaves following selenium foliar fertilization2.2 叶面施硒肥对箭叶淫羊藿生物量及硒含量的影响
本研究分析了叶面施硒肥对箭叶淫羊藿生物量及叶片硒含量的影响，结果见表1。整体上来看，不同浓度的亚硒酸钠处理对箭叶淫羊藿叶片的生物量和硒含量均表现为促进作用。在实验所选的硒浓度范围内，叶片生物量在高浓度下不仅没有受到抑制，还表现出一定的促进作用，但叶片干重与硒浓度之间相关性不显著。同时，箭叶淫羊藿叶片中的硒含量随硒处理浓度的升高而增加，两者显著相关。
表 1 不同施硒水平对箭叶淫羊藿叶片生物量和硒含量的影响Table 1. Effects of selenium at different levels on biomass and selenium content in Epimedium sagittatum leaves指标 Index 硒水平
Selenium level / mg/kgr 0 10 20 30 40 50 叶干重 / g 3.350±0.810 4.230±1.100 3.180±0.560 5.600±1.250 4.640±1.730 6.770±1.450 0.6529 硒含量 / mg/kg 0.003±0.001 3.360±0.290 5.280±0.170 7.840±1.360 8.290±1.560 9.770±2.230 0.9490 注：r表示各指标与硒水平之间的相关系数。 Note: r represents the correlation coefficient between indicator and selenium level. 2.3 硒处理对箭叶淫羊藿中总黄酮含量的影响
硒处理对箭叶淫羊藿中总黄酮含量的影响如图3所示。各处理组叶片的总黄酮含量均有所上升，且与对照组差异显著。与对照相比，40 mg/kg和50 mg/kg处理组的叶片总黄酮含量均显著提高，且呈现出显著的硒浓度依赖性。
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图 3 箭叶淫羊藿叶片中总黄酮的含量不同小写字母表示处理间在P<0.05水平上差异显著。下同。Figure 3. Total flavonoid content in Epimedium sagittatum leavesDifferent lowercase letters indicate significant differences at P<0.05 level. Same below.2.4 富硒对箭叶淫羊藿中淫羊藿苷及朝藿定A、B、C含量的影响
测定不同处理植物叶片中的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷含量，结果如图4所示。除了10 mg/kg处理组中朝藿定A的含量有所降低之外，其余各处理组均大幅度上升，且各处理组之间差异显著（P<0.05）。朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的含量均随着硒浓度的提升而成倍增加，各处理组之间差异显著（P<0.05）。总体来说，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷在植物叶片中的积累均表现出明显的硒依赖性，其中50 mg/kg处理组的效果最佳。
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图 4 淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 的含量Figure 4. Icariin, epimedin A, epimedin B, and epimedin C content in Epimedium sagittatum leaves3. 讨论
研究表明，适量的硒可以显著减少作物中重金属的积累，不同植物硒的适宜浓度也不相同[24-26]。本文比较了两种外源施硒方式对箭叶淫羊藿叶片吸收有害元素的影响，结果发现，土壤施硒条件下，低浓度（10 mg/kg）处理可降低植物对有害元素的吸收，而高浓度处理则效果下降；叶面施硒条件下，淫羊藿对4种有害元素的吸收量均随着硒浓度的增加而显著减少。因此，推测箭叶淫羊藿根部吸收硒元素过程中，与有害元素存在协同增效的作用，但通过叶面施硒时，较高浓度的硒元素增强了根的选择性吸收功能，从而大大降低了植物对有害元素的吸收。
本实验结果发现，硒浓度的持续增加对箭叶淫羊藿的生长有一定的促进作用，这与前人报道的高浓度硒显著抑制植物生长的结论有所不同[27, 28]。此外，箭叶淫羊藿叶片的硒含量也有显著增加，这与Dhillon和Dhillon[29]在农作物以及张海英等[30]在其他植物上的研究结果一致；表明箭叶淫羊藿是一种耐硒植物，且叶面施硒能在一定程度上提高产量。高浓度硒处理没有抑制箭叶淫羊藿对硒的吸收，其富集程度反而进一步增强，说明该物种对硒的吸收和转化机制相当复杂，值得进一步研究。
研究表明，硒可影响植物的次生代谢，如能增加银杏（Ginkgo biloba L.）叶中黄酮类化合物的含量[31]，而抑制枸杞（Lycium chinense Mill.）中槲皮素和芦丁的合成[23]。本文中，我们发现，硒处理能够显著提高箭叶淫羊藿叶片中总黄酮及朝藿定A、B、C的含量，加速其代谢积累，表明叶面施硒有助于生产高品质的淫羊藿药材，在生产中具有很好的应用前景。
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图 1 引物Sam1在不同样本中的扩增图
Figure 1. Polymorphic fingerprints detected by Sam1 for different samples
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图 3 29个刺梨居群的主坐标分析图
Figure 3. Principal coordinate analysis of 29 populations of Rosa roxburghii
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图 4 刺梨群体地理距离和Nei’s标准遗传距离的Mantel相关性检验
Figure 4. Mantel-test between geographical distance and Nei’s standard genetic distance of Rosa roxburghii populations
表 1 野生刺梨采样数量情况
Table 1 Number of wild Rosa roxburghii samples
编号
Code居群
Population数量
Number编号
Code居群
Population数量
NumberDS 贵州省独山县 12 PL 陕西省平利县 3 DY 贵州省都匀市 8 PY 江西省鄱阳县 5 FQ 贵州省福泉市 6 BJ 湖南省保靖县 5 GD 贵州省贵定县 36 ES 湖北省恩施市 8 HS 贵州省惠水县 3 XE 湖北省宣恩县 10 LL 贵州省龙里县 3 DJY 四川省都江堰 3 PT 贵州省平塘县 4 MN 四川省冕宁县 12 SD 贵州省三都县 15 AZ 四川省安州区 5 WA 贵州省瓮安县 20 YY 重庆市酉阳县 13 XR 贵州省兴仁市 4 BN 重庆市巴南区 16 LZ 贵州省六枝特区 5 LPQ 重庆市梁平区 4 SC 贵州省水城区 6 ZX 云南省镇雄市 10 CS 贵州省长顺县 6 YJ 云南省盐津县 17 LP 贵州省黎平县 4 SF 云南省水富市 6 NQ 陕西省宁强县 12 
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表 2 刺梨多态性引物
Table 2 Polymorphic primers of Rosa roxburghii
引物
Primer引物序列（5′→3′）
Primer sequence（5′→3′）来源
Source重复基元
Repeated motif产物大小
Product size / bpRox1 F: AATATACACGAACAACAACCATCG
R: GGAACATGACCCCTTTTCTTATT刺梨
R. roxburghii（CTACA）4 147 Rox2 F: GAGTCATGTTGAATGATATTGGC
R: TTTCCTCTTTTCTTCTTTTTCCC刺梨 （TGGA）13 131 Rox3 F: TGAGAACCAAAAGAAACGACTACA
R: GTCACAAATTCACGAGCCATATT刺梨 （AT）8 146 Rox4 F: GAGAGAGTAGCCTTTGATGAGGA
R: GAATGTCGTCAGGGAGCAGTAG刺梨 （CTC）7 146 Sam1 F: ATGCCCTTTTGATGTGCTGGTAGAG
R: TCGGATCTTCTTGTGCTGTTTCTCC月季
R. chinensis（AG）5 233 Sam2 F: TGGTGGCAAACAGGAGAAGATATGG
R: GCAACATCTGCACAACTGGAAGC月季 （GA）5 211 Sam3 F: GCAACAACAGCAACAACTTCCTTTG
R: GTTGGAGTGGCAGTTGATGCTTATG月季 （CAA）5 245 Sam4 F: GTTGCTCCACAGATGCCTCAGTC
R: TGGTTGAAATTGCTGCTGTTGTTGG月季 （CAG）5 258 Sam5 F: GAACCAAGTCCTTCCGCAAA
R: CCAACATAGCGGTTGCTTGA月季 （CTT）5 223 Sam6 F: GTGTACTATCGAGCCGATCCAGGAG
R: AACCACGCTTCAATGGCTCATCC月季 （CT）5 200
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表 3 10对SSR引物在261份刺梨种质中的遗传信息
Table 3 Genetic information of 10 SSR primers in 261 Rosa roxburghii germplasms
引物Primer 等位基因数 Number of alleles 有效等位基因数 Effective number of alleles Shannon’s指数Shannon information index 观测杂合度Observed heterozygosity 期望杂合度Effective heterozygosity 多态信息含量Polymorphism information content Sam1 7 1.305 0.307 0.073 0.180 0.227 Sam2 13 1.640 0.476 0.060 0.288 0.503 Sam3 9 1.832 0.661 0.394 0.401 0.456 Sam4 8 2.365 0.986 0.731 0.551 0.548 Sam5 11 2.284 0.913 0.708 0.550 0.576 Sam6 13 2.078 0.813 0.538 0.481 0.521 Rox1 14 2.688 0.997 0.457 0.550 0.750 Rox2 5 2.410 0.903 0.714 0.554 0.599 Rox3 11 3.597 1.323 0.758 0.690 0.782 Rox4 11 3.115 1.200 0.649 0.634 0.718 平均值 10.2 2.311 0.858 0.508 0.488 0.568
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表 4 不同居群平均多样性指数
Table 4 Average diversity index of different populations
群体
Population等位基因数
Number of
alleles有效等位基因数
Effective number
of allelesShannon’s指数
Shannon information
index观测杂合度
Observed
heterozygosity期望杂合度
Observed
heterozygosity固定指数
Fixation index多态性位点比率
Polymorphic
site rate / %CS 3.300 2.170 0.868 0.322 0.479 0.346 90.00 DS 3.700 2.780 1.035 0.656 0.572 −0.075 100.00 DY 3.400 2.452 0.941 0.489 0.530 0.064 100.00 FQ 2.900 2.320 0.852 0.463 0.504 0.080 100.00 GD 5.400 2.433 1.013 0.545 0.523 −0.013 100.00 HS 2.000 1.678 0.584 0.450 0.376 −0.192 80.00 LP 2.600 2.078 0.786 0.300 0.482 0.390 100.00 LL 2.600 2.161 0.763 0.517 0.449 −0.186 80.00 PT 2.300 1.877 0.672 0.417 0.426 0.002 90.00 SD 3.500 2.563 0.959 0.661 0.537 −0.165 100.00 WA 3.900 2.536 0.987 0.587 0.535 0.035 100.00 XR 2.300 2.032 0.666 0.600 0.419 −0.472 80.00 LZ 2.400 2.117 0.731 0.675 0.435 −0.561 70.00 SC 2.500 2.008 0.666 0.583 0.391 −0.503 70.00 ES 3.500 2.585 1.033 0.419 0.588 0.307 100.00 XE 3.700 2.533 0.997 0.401 0.540 0.272 100.00 BJ 3.500 2.952 1.062 0.647 0.588 −0.076 90.00 PY 2.500 2.121 0.705 0.340 0.412 0.138 70.00 NQ 4.600 3.223 1.233 0.731 0.645 −0.118 100.00 PL 1.800 1.530 0.476 0.433 0.306 −0.363 70.00 DJY 1.600 1.500 0.381 0.300 0.238 −0.300 40.00 MN 3.500 2.494 0.953 0.553 0.522 0.003 90.00 AZ 3.100 2.489 0.898 0.360 0.503 0.254 90.00 SF 3.000 2.154 0.848 0.440 0.495 0.101 90.00 YJ 4.000 2.877 1.076 0.490 0.562 0.182 100.00 ZX 3.000 2.382 0.894 0.411 0.522 0.286 100.00 LPQ 2.500 2.160 0.699 0.592 0.418 −0.446 80.00 YY 3.700 2.769 1.059 0.680 0.587 −0.185 100.00 BN 4.000 2.631 1.044 0.673 0.565 −0.067 100.00 平均值 3.131 2.331 0.858 0.508 0.488 −0.019 88.97
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表 5 各SSR位点F-statistics及基因流
Table 5 F-statistics and gene flow for each SSR microsatellite locus
位点Locus 居群内分化系数
Within-population differentiation coefficient总近交系数
Total inbreeding coefficient基因流Gene flow Sam1 0.142 0.819 1.516 Sam2 0.116 0.918 1.899 Sam3 0.041 0.110 5.828 Sam4 0.039 −0.306 6.084 Sam5 0.091 −0.170 2.503 Sam6 0.044 0.242 5.400 Rox1 0.084 0.623 2.716 Rox2 0.040 0.268 6.008 Rox3 0.038 0.195 6.352 Rox4 0.035 0.065 6.805 平均 值 0.067 0.276 4.511
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表 6 刺梨29个居群分子方差分析
Table 6 Analysis of molecular variance （AMOVA）of 29 Rosa roxburghii populations
变异来源
Variance source自由度
df离均差平方和
SS均方
MS估计方差
Estimated variance变异百分比
Percentage variation / %群体间 28 213.437 7.623 0.211 6.36 群体内 493 1 509.647 6.218 3.109 93.64 总计 521 1 723.084 3.320 100
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