Cloning and Expression Pattern Analysis of the ApNAP Gene in Asarina procumbens
-
摘要: 金鱼藤（Asarina procumbens）是玄参科金鱼藤属多年生藤本植物，在园林中常用于垂直绿化，是良好的观赏植物，但金鱼藤叶片衰老后很快干枯并脱落，仅留光秃的茎蔓，使其观赏价值大大降低。AtNAP是拟南芥NAC基因家族中与衰老相关的转录因子，在调控叶片衰老过程中有重要的作用。本研究以金鱼藤衰老叶片为材料，运用RT-PCR和RACE技术克隆金鱼藤中ApNAP基因cDNA序列。结果显示，该基因位于细胞核中，cDNA全长为1341 bp，开放阅读框为936 bp，编码311个氨基酸，相对分子量为35.21 kD，等电点为9.13；ApNAP基因组全长1526 bp，含有2个内含子和3个外显子。多重序列比对表明，ApNAP属于NAC转录因子家族。系统进化树分析显示，ApNAP属于NAP亚组，与AtNAM的同源关系最近。实时荧光定量PCR结果表明，受自然状态下衰老和黑暗处理的诱导，ApNAP基因表达量增加，这进一步说明ApNAP基因参与调控金鱼藤叶片衰老的过程。该基因的分离对利用转基因技术延缓金鱼藤叶片衰老，提高金鱼藤在园林绿化中的观赏价值具有实际意义。Abstract: Asarina procumbens, Scrophulariaceae, is a perennial vine and good ornamental plant for vertical greening in the garden. However, when the leaves of A.procumbens become dry and abscised after senescing, the bare tendrils greatly reduce its ornamental value. AtNAP is a NAC family transcription factor gene that plays a key role in regulating leaf senescence in Arabidopsis. In this study, ApNAP, a homologous gene of AtNAP, was cloned from A.procumbens senescent leaves by RT-PCR and RACE. Results showed that the ApNAP gene was located in the nucleus and had a total length of 1341 bp with an open reading frame of 936 bp, encoding 311 amino acids, of which the relative molecular weight was 35.21 kD and the isoelectric point was 9.13. The length of the genome was 1526 bp with two introns and three exons. Multiple sequence alignment indicated that the ApNAP gene was a NAC transcription factor. Phylogenetic analysis indicated that the ApNAP gene belonged to the NAP subfamily and shared highest similarity with AtNAM in Arabidopsis. The results of real-time qPCR showed that the expression level of ApNAP was increased under treatments induced by natural and dark-induced senescence, indicating that it was involved in the regulation of the leaf senescent process of A.procumbens. The isolation and cloning of ApNAP had an important value in delaying leaf senescence and improving the greening value of A.procumbens.
-
Keywords:
- Asarina procumbens /
- Gene cloning /
- ApNAP /
- Real-time qPCR
-
箭叶淫羊藿（Epimedium sagittatum (Sieb. et zucc.) Maxim.）为小檗科淫羊藿属（Epimedium）多年生草本植物，属于药食同源植物。淫羊藿始载于《神农本草经》，在中国已有2 000多年的应用历史，是我国应用最广泛、最古老的药材之一[1]。淫羊藿化学成分丰富，不仅有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效，还具有抗衰老、增强免疫、抑制肿瘤等功能，因此也是最有开发潜力的中药材之一[2, 3]。但淫羊藿也存在种子休眠、发芽困难、繁殖系数低等问题，与中药市场不断增长的需求相矛盾，长期以来，造成了野生资源的严重减少[4, 5]。因此，人工栽培淫羊藿的需求日益增长。Yang等[6]对来自中国30个省、自治区、直辖市的样本进行了重金属含量测定，发现淫羊藿叶片中重金属含量差异较大，铜（Cu）和铅（Pb）是污染该植物最主要的重金属。
硒（Se）是人类和动物必需的14种微量元素之一[7]。1973年，世界卫生组织将硒正式列为人体必需的微量元素之一[8]。1988年，中国营养学会将硒列为每日膳食营养素，建议硒摄入量为50 μg/d[9]。日常摄入硒元素有助于增强免疫力、预防癌症、清除自由基等[10-13]。硒元素能够通过上调一系列抗氧化酶的活性，增加黄酮类、多酚类、抗坏血酸等低分子量物质的浓度，减少重金属在植物中的累积[14-18]。低浓度的硒还可以促进植物生长[19-21]。
富硒栽培技术目前已经涉及到粮食、水果、蔬菜及中药材等多个领域，而对淫羊藿的富硒研究很有限。本文比较了两种不同施硒方式下箭叶淫羊藿吸收有害元素铅、镉（Cd）、汞（Hg）、砷（As）的差异，并采用叶面喷施方式，分析了不同浓度硒处理下植物中总黄酮、淫羊藿苷和朝藿定A、B、C的含量变化，研究结果旨在为箭叶淫羊藿资源的进一步开发和利用提供参考。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
箭叶淫羊藿植物材料由中国科学院武汉植物园提供，均为一年生实生幼苗，具2~3个叶片。亚硒酸钠购自阿法埃莎（中国）化学有限公司；淫羊藿苷、朝藿定A、B、C对照品购自成都普斯生物技术有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 富硒栽培
土壤硒肥的配制：参照本实验室的富硒MS培养液配制方法[22]，配制硒浓度分别为0、10、20、30、40、50 mg/kg的MS营养液，再将浓度为15 mg/kg的铅、汞、镉、砷等依次加入富硒培养液中，按照3∶7的质量比与蛭石混合，即制得淫羊藿幼苗栽培培养基。
叶面硒肥的配制：MS培养液直接与蛭石按比例混合成营养土。配制浓度为0.5 mg/mL的亚硒酸钠母液，同时设置5个剂量，即10、20、30、40、50 mg/kg，以纯净水作为对照。将箭叶淫羊藿幼苗栽培在营养土中，控制湿度为75%，纯净水补充水分，自然光照，缓冲生长30 d，每周叶面喷施1次亚硒酸钠溶液，对照组喷施等量的清水，生长90 d后收获，去掉叶柄，65 ℃烘干后计算单株叶片干重，然后粉碎，过40目筛，保存备用。
1.2.2 有害元素及硒含量的测定
箭叶淫羊藿中的有害元素由湖北省农科院农产品质量检验所分析，方法参照标准为GB/T
17134 -1997。硒含量的测定均采用GB 5009.93-2017中氢化物原子荧光光谱法，由湖北琪谱检测技术有限公司进行分析。1.2.3 总黄酮标准曲线的绘制及含量测定
标准曲线的绘制：以淫羊藿苷对照品，参照《中国药典》2020版的方法[23]，配制标准溶液，以甲醇作空白对照，采用紫外可见分光光度计在270 nm处测定吸光度。以吸光度Y对淫羊藿苷浓度X（μg/mL）进行线性回归，得线性回归方程Y=0.375 1X+0.028 7，r2=0.999 9。
总黄酮含量测定：精确称取5份箭叶淫羊藿粗粉，每份200 mg，分别加入70%乙醇20 mL，超声提取30 min，取滤液0.5 mL，定容至50 mL。以甲醇为对照，在270 nm处测定吸光度，并根据线性回归方程计算样品中总黄酮的含量。
1.2.4 淫羊藿苷及朝藿定A、B、C含量测定
液相色谱条件：Agilent ZORBAX TC-C18色谱柱（5 μm，4.6×250 mm，美国）；流动相A为乙酸（0.5%），B为乙腈，梯度洗脱（0~30 min 25%B；30~40 min 100%B；40~50 min 25%B）；流速1 mL/min；柱温30 ℃；进样量5 μL；检测波长272 nm。
对照品溶液的制备：精确称取朝霍定A、朝霍定B、朝霍定C和淫羊藿苷对照品各5 mg，用70%乙醇配制成1 mg/mL的母液，以此为对照品绘制标准曲线。以此标准曲线计算样品中朝霍定A、朝霍定B、朝霍定C和淫羊藿苷的含量。
1.3 数据处理
采用Excel 2020和SPSS 24.0软件进行数据分析和作图，结果以平均值±标准差表示。
2. 结果与分析
2.1 不同施硒肥方式对箭叶淫羊藿有害元素吸收的影响
土壤施硒处理下，箭叶淫羊藿对有害元素的吸收如图1所示。与对照组相比，10 mg/kg处理组叶片中4种有害元素的含量明显降低，说明土壤中较低浓度的硒可以抑制箭叶淫羊藿对有害元素的吸收。随着土壤中硒浓度的上升，箭叶淫羊藿对Pb、Hg、Cd的吸收呈上升趋势，而对As的吸收先升后降，表明高浓度的硒可促进箭叶淫羊藿对有害元素的吸收，特别是对Cd吸收的促进最强，其次是Pb和Hg。
![]()
图 1 土壤施硒肥下箭叶淫羊藿叶片中有害元素的含量Figure 1. Harmful element content in Epimedium sagittatum leaves following selenium soil cultivation叶面施硒对箭叶淫羊藿吸收有害元素的影响如图2所示。4种元素的含量均随硒浓度的增加呈下降趋势。其中，对Cd的抑制效应尤为明显，其次是As、Pb、Hg。
![]()
图 2 叶面施硒肥下箭叶淫羊藿叶片中有害元素的含量Figure 2. Harmful element content in Epimedium sagittatum leaves following selenium foliar fertilization2.2 叶面施硒肥对箭叶淫羊藿生物量及硒含量的影响
本研究分析了叶面施硒肥对箭叶淫羊藿生物量及叶片硒含量的影响，结果见表1。整体上来看，不同浓度的亚硒酸钠处理对箭叶淫羊藿叶片的生物量和硒含量均表现为促进作用。在实验所选的硒浓度范围内，叶片生物量在高浓度下不仅没有受到抑制，还表现出一定的促进作用，但叶片干重与硒浓度之间相关性不显著。同时，箭叶淫羊藿叶片中的硒含量随硒处理浓度的升高而增加，两者显著相关。
表 1 不同施硒水平对箭叶淫羊藿叶片生物量和硒含量的影响Table 1. Effects of selenium at different levels on biomass and selenium content in Epimedium sagittatum leaves指标 Index 硒水平
Selenium level / mg/kgr 0 10 20 30 40 50 叶干重 / g 3.350±0.810 4.230±1.100 3.180±0.560 5.600±1.250 4.640±1.730 6.770±1.450 0.6529 硒含量 / mg/kg 0.003±0.001 3.360±0.290 5.280±0.170 7.840±1.360 8.290±1.560 9.770±2.230 0.9490 注：r表示各指标与硒水平之间的相关系数。 Note: r represents the correlation coefficient between indicator and selenium level. 2.3 硒处理对箭叶淫羊藿中总黄酮含量的影响
硒处理对箭叶淫羊藿中总黄酮含量的影响如图3所示。各处理组叶片的总黄酮含量均有所上升，且与对照组差异显著。与对照相比，40 mg/kg和50 mg/kg处理组的叶片总黄酮含量均显著提高，且呈现出显著的硒浓度依赖性。
![]()
图 3 箭叶淫羊藿叶片中总黄酮的含量不同小写字母表示处理间在P<0.05水平上差异显著。下同。Figure 3. Total flavonoid content in Epimedium sagittatum leavesDifferent lowercase letters indicate significant differences at P<0.05 level. Same below.2.4 富硒对箭叶淫羊藿中淫羊藿苷及朝藿定A、B、C含量的影响
测定不同处理植物叶片中的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷含量，结果如图4所示。除了10 mg/kg处理组中朝藿定A的含量有所降低之外，其余各处理组均大幅度上升，且各处理组之间差异显著（P<0.05）。朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的含量均随着硒浓度的提升而成倍增加，各处理组之间差异显著（P<0.05）。总体来说，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷在植物叶片中的积累均表现出明显的硒依赖性，其中50 mg/kg处理组的效果最佳。
![]()
图 4 淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 的含量Figure 4. Icariin, epimedin A, epimedin B, and epimedin C content in Epimedium sagittatum leaves3. 讨论
研究表明，适量的硒可以显著减少作物中重金属的积累，不同植物硒的适宜浓度也不相同[24-26]。本文比较了两种外源施硒方式对箭叶淫羊藿叶片吸收有害元素的影响，结果发现，土壤施硒条件下，低浓度（10 mg/kg）处理可降低植物对有害元素的吸收，而高浓度处理则效果下降；叶面施硒条件下，淫羊藿对4种有害元素的吸收量均随着硒浓度的增加而显著减少。因此，推测箭叶淫羊藿根部吸收硒元素过程中，与有害元素存在协同增效的作用，但通过叶面施硒时，较高浓度的硒元素增强了根的选择性吸收功能，从而大大降低了植物对有害元素的吸收。
本实验结果发现，硒浓度的持续增加对箭叶淫羊藿的生长有一定的促进作用，这与前人报道的高浓度硒显著抑制植物生长的结论有所不同[27, 28]。此外，箭叶淫羊藿叶片的硒含量也有显著增加，这与Dhillon和Dhillon[29]在农作物以及张海英等[30]在其他植物上的研究结果一致；表明箭叶淫羊藿是一种耐硒植物，且叶面施硒能在一定程度上提高产量。高浓度硒处理没有抑制箭叶淫羊藿对硒的吸收，其富集程度反而进一步增强，说明该物种对硒的吸收和转化机制相当复杂，值得进一步研究。
研究表明，硒可影响植物的次生代谢，如能增加银杏（Ginkgo biloba L.）叶中黄酮类化合物的含量[31]，而抑制枸杞（Lycium chinense Mill.）中槲皮素和芦丁的合成[23]。本文中，我们发现，硒处理能够显著提高箭叶淫羊藿叶片中总黄酮及朝藿定A、B、C的含量，加速其代谢积累，表明叶面施硒有助于生产高品质的淫羊藿药材，在生产中具有很好的应用前景。
-
[1] 张美恒, 胡翠平, 樊金萍. 金鱼藤的组织培养和快速繁殖体系的建立[J]. 作物杂志, 2012(2): 59-62. [2] Lim PO, Kim HJ, Nam HG. Leaf senescence[J]. Annu Rev Plant Biol,2007, 58: 115-136.
[3] 梁秋霞, 曹刚强, 苏明杰, 秦广雍. 植物叶片衰老研究进展[J]. 中国农学通报, 2006, 22(8): 282-285. [4] Gan S, Amasino RM. Making sense of senescence (molecular genetic regulation and manipulation of leaf senescence) [J]. Plant Physi, 1997, 113(2): 313-319.
[5] Duval M, Hseieh AN, Skriver K. Molecular characterization of AtNAM: a member of the Arabidopsis NAC domain super family[J]. Plant Mol Biol, 2002, 50: 237-248.
[6] Ooka H, Satoh K, Doi K. Comprehensive analysis of NAC family genes in Oryza sativa and Arabidopsis thaliana[J]. DNA Res, 2003, 10(6): 239-247.
[7] Souer E, Houwelingen A, Kloos D, Mol J, Koes R. The no apical meristem gene of Petunia is required for pattern formation in embryos and flowers and is expressed at meristem and primordia boundaries[J]. Cell, 1996, 85: 159-170.
[8] 李伟, 韩蕾, 钱永强, 孙振元. 植物NAC转录因子的种类、特征及分类[J]. 应用与环境生物学报, 2011, 17(4): 596-606. [9] Ernst HA, Olsen AN, Skriver K, Larsen S, Leggio LL. Structure of the conserved domain of ANAC, a member of the NAC family of transcription factors[J]. EMBO Rep, 2004, 5 (3): 297-303.
[10] Jensen MK, Rung JH, Gregersen PL, Gjetting T, Fuglsang AT, Hansen M, Joehnk N, Lyngkjaer MF, Collinge DB. The HvNAC6 transcription factor: A positive regulator of penetration resistance in barley and Arabidopsis[J]. Plant Mol Biol, 2007, 65 (1-2): 137-150.
[11] He XJ, Mu RL, Cao WH, Zhang ZG, Zhang JS, Chen SY. AtNAC2,a transcription factor downstream of ethylene and auxin signaling pathways,is involved in salt stress response and lateral root development[J]. Plant J, 2005, 44: 903-916.
[12] Uauy C, Distelfeld A, Fahima T, Blechl A, Dubcovsky J. A NAC gene regulating senescence improves grain protein,zinc,and iron content in wheat[J]. Science, 2006, 314: 1298-1301.
[13] Balazadeh S,Kwasniewski M, Caldana C. ORSI, an H2O2-responsive NAC transcription factor, controls senescence in Arabidopsis thaliana[J]. Mol Plant, 2011, 4(2): 346-360.
[14] Guo YF, Gan S. AtNAP, a NAC family transcription factor has an important role in leaf senescence[J]. Plant J, 2006, 46(4): 601-612.
[15] Mitsuda N, Iwase A, Yamamoto H, Yoshida M, Seki M, Shinozaki K, Ohme TM. The NAC transcription factors, NST1 and NST3, are key regulators of the formation of secondary walls in woody tissues of Arabidopsis[J]. Plant Cell, 2007, 19: 270-280.
[16] Mitsuda N, Seki M, Shinozaki K, Ohme TM. The NAC transcription factors NST1 and NST2 of Arabidopsis regulates secondary wall thickening and are required for another dehiscence[J]. Plant Cell, 2005, 17: 2993-3006.
[17] Zhong R, Demura T, Ye ZH. SND1, a NAC domain transcription factor, is a key regulator of secondary wall synthesis in fibers of Arabidopsis[J]. Plant Cell, 2006, 18: 3158-3170.
[18] Yoo SY, Kim Y, Kim SY, Lee JS, Ahn JH. Control of flowering time and cold response by a NAC-domain protein in Arabidopsis[J]. PLoS One, 2007, 2(7): 637-642.
[19] Nakashima K, Tran LP, Nguyen DV, Fujita M, Maruyama K, Todaka D, Ito Y, Hayashi N, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. Functional analysis of a NAC-type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress responsive gene expression in rice[J]. Plant J, 2007, 51: 617-630.
[20] Sablowski RW, Meyerowitz EM. A homolog of NO APICAL MERISTEM is an immediate target of the floral homeotic genes APETALA3/PISTILLATA[J]. Cell, 1998, 92(1): 93-103.
[21] Liu YZ, Baig RMN, Fan R, Ye JY. Identification and expression pattern of a novel NAM,ATAF,and CUC-Like gene from Citrus sinensis Osbeck[J]. Plant Mol Biol Rep, 2009, 27(3): 292-297.
[22] Kalivas A, Pasentsis K, Arglriou A, Darentas N, Tsaftaris AS. FamRCA-RACE: a rolling circle amplification race for isolating a family of homologous cDNAs in one reaction and its application to obtain NAC genes transcription factors from crocus (Crocus sativus) flower[J]. Prep Bioehem Biotechnol, 2010, 40(3): 177-187.
[23] 唐雪蓉, 张如奎, 陈旭, 吴秀菊, 明凤. 水稻OsNAP基因的功能分析及其在育种价值方面的研究[J]. 复旦大学学报:自然科学版, 2012, 51(4): 506-514. [24] 郭玉娟, 魏强, 蒯本科. 高羊茅中衰老相关转录因子AtNAP同源基因的分离及功能分析[J]. 复旦大学学报:自然科学版, 2010, 49(5): 544-553. [25] 陈云霞. 竹子中叶片衰老相关基因的分离与功能分析[D]. 南京:南京林业大学,2011. [26] 高俊凤. 植物生理学实验指导[M]. 北京:高等教育出版社,2006:5-6. [27] Kalivas A, Pasentsis K, Arglriou A, Darentas N, Tsaftaris AS. Isolation, characterization and expression analysis of an NAP-like cDNA from Crocus (Crocus sativus L.) [J]. Plant Mol Biol Rep, 2010, 28: 654-663.
[28] Zhou Y, Huang WF, Liu L, Lin YJ. Identification and functional characterization of a rice NAC gene involved in the regulation of leaf senescence[J]. BMC Plant Biol, 2013,13: 132-144.
[29] Zhang KW, Gan SS. An abscisic acid-AtNAP transcription factor-SAG113 protein phosphatase 2C regulatory chain for controlling dehydration in senescing Arabidopsis leaves[J]. Plant Physiol, 2012,158: 961-969.
下载:
计量
- 文章访问数: 1248
- HTML全文浏览量: 2
- PDF下载量: 1533
