海棠（Malus spp.）是蔷薇科苹果属（Malus）中果实较小（ ≤5 cm）的一类植物的总称^[1]。在园林景观应用中，通常将具有观赏价值的海棠统称为观赏海棠，包括种及种下变种和品种^{[2, 3]}。观赏海棠的品种较多，其花色艳丽、观赏期长、适应性强、分布范围广，是重要的温带观花观果树木^[4-6]。20世纪80年代以来，我国从欧美国家引种了近百种观赏海棠，在西北、华北、华东地区大量栽培，并在园艺方面推广应用。近年来，在植物育种研究过程中，遗传信息的挖掘成为一项重要的基础性工作。但目前对观赏海棠在基因和基因组水平上的研究还很缺乏，很大程度上限制了我们对海棠资源的高效利用。

基因组大小也称基因组C值（C-value），指的是单倍体细胞中全套染色体的DNA总量，以质量（Picogram，pg）或碱基对数目（Million base pair，Mb）作为度量单位^{[7, 8]}。C值的测定不仅可以估测一个物种的DNA含量，而且可以为目标物种后续的基因组测序、基因组学及进化生物学研究提供数据参考，此外也是生物学家进行物种分类和种群进化分析的重要依据^[9-11]。目前，基因组大小的测定方法主要有3种：基因组测序法、孚耳根染色法（Feulgen staining）以及流式细胞术（Flow cytometry，FCM）。FCM因其样本制备方法简单且快捷、试剂成本低廉、实验结果可靠等被广泛使用^[12-15]。

目前，大量关于植物基因组的研究已被报道，主要集中在植物DNA C值数据库（Plant DNA C-values Database；https://cvalues.science. kew.org/）中。网站已在全球范围内收录了12 273个物种的C值数据，其中被子植物约10 770种，苹果属种质资源的C值数据为73份。然而，有关观赏海棠品种的数据仍鲜有报道。因此，本研究选取18个具有较高经济价值和广泛栽培价值的欧美引进品种为研究对象，利用流式细胞术进行C值测定及基因组大小评估，研究结果旨在为观赏海棠种质资源鉴定、基因组学研究以及新品种培育提供理论基础。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

18个观赏海棠品种均为南京林业大学海棠种质资源圃10年以上的植株（表1）。该资源圃位于江苏省扬州市江都区仙女镇（32°42' N，119°55' E），管理和栽培环境基本一致。于2023年4-5月，采集10片以上新抽出的幼嫩叶片用冰盒保存带回实验室，放置4 ℃冰箱内，在2 d内完成流式细胞术检测。以二倍体玉米（Zea mays L.）品种‘B73’萌发后1个月的嫩叶作为内参标样，其基因组大小为2.4 Gb。

表  1  供试海棠品种名称

Table  1.  Malus spp. cultivar list applied in the test

序号 Code	品种 Cultivars		序号 Code	品种 Cultivars
1	‘春之韵’ ‘Spring Sensation’		10	‘灰姑娘’ ‘Cinderella’
2	‘蒂娜’ ‘Tina’		11	‘火鸟’ ‘Firebird’
3	‘范艾斯汀’ ‘Van Eseltine’		12	‘金丰收’ ‘Harvest Gold’
4	‘高原红’ ‘Prairifire’		13	‘金雨滴’ ‘Golden Raindrop’
5	‘红哨兵’ ‘Red Sentinel’		14	‘玛丽波特’ ‘Mary Potter’
6	‘红衣主教’ ‘Cardinal’		15	‘美果海棠’ ‘Calocarpa’
7	‘红珠宝’ ‘Red Jewel’		16	‘时光秀’ ‘Show Time’
8	‘皇家雨点’ ‘Royal Raindrop’		17	‘斯普伦格’ ‘Professor Sprenger’
9	‘黄金甲’ ‘Fairytail Gold’		18	‘紫王子’ ‘Purple Prince’

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1.2   实验方法

1.2.1   解离液的选择与荧光染料配置

分别采用LB01 buffer、mGb buffer、Galbraith’s buffer、Tris·MgCl₂ buffer 4种配方进行实验，参考汪艳等^[16]的方法，找出测定观赏海棠基因组的最佳裂解液配方，配好的裂解液置于4 ℃冰箱内冷藏保存。

1.2.2   细胞核悬液制备与DNA特异性染色

实验操作参照Galbraith^[17]的方法并做部分改进。首先，将1 cm²的待测样品与等体积的标样一起置于冰盒上的培养皿中，加入1 mL预冷的细胞核裂解液，用锋利的刀片快速切碎。然后使用400目滤网过滤至1.5 mL的EP管中，获得细胞核悬液，置于冰上孵育5 min。最后向制备好的细胞核悬液中加入50 μL碘化丙啶（PI）染液（浓度为1 mg/mL）及1 μL RNase（10 mg/mL），混匀后放置4 ℃冰箱中，避光染色20 min后上机检测。

1.2.3   确定对照与处理荧光强度大致范围

先将内标玉米‘B73’单独上机检测，初步确定内标的相对荧光强度范围，保存好检测模板。然后在同一检测模板下，随机选取3个观赏海棠样品，确定其相对荧光强度范围，然后作下记录。结合机器的调节条件及便于识别，本实验所有的样品峰均为P4峰，内标峰均为P5峰（图1、图2）。

图  1  不同内标与观赏海棠‘皇家雨点’的流式直方图

A：大豆和‘皇家雨点’；B：水稻和‘皇家雨点’；C：楸子和‘皇家雨点’；D：玉米和‘皇家雨点’。P4：‘皇家雨点’峰位；P5：内标峰位；CV表示变异系数。

Figure  1.  Flow histograms of different internal indexes and Malus ‘Royal Raindrop’

A: Glycine max and ‘Royal Raindrop’; B: Oryza sativa and ‘Royal Raindrop’; C: M. Prunifolia and ‘Royal Raindrop’; D: Zea mays and ‘Royal Raindrop’. P4: ‘Royal Raindrop’ peak; P5: Internal standard peak; CV represents coefficient of variation.

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图  2  部分观赏海棠与标样混合样本的流式直方图

A：‘黄金甲’和玉米； B：‘火鸟’和玉米；C：‘玛丽波特’和玉米。P4：观赏海棠峰位；P5：玉米峰位。

Figure  2.  Flow cytometry results of mixed samples of some Malus spp. and standard sample

A: ‘Fairytail Gold’ and Zea mays; B: ‘Firebird’ and Zea mays; C: ‘Mary Potter’ and Zea mays. P4: Peak position of ornamental crabapple; P5: Zea mays peak.

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1.2.4   流式细胞仪检测

本实验在南京林业大学现代分析测试中心进行。首先将Canto^TM Ⅱ流式细胞仪（美国BD）预热30 min，用荧光微球校准各荧光通道，之后对染色后的细胞核悬液样品进行上机检测。染色后的样品经过488 nm蓝光激发后，收集585/42通道的荧光，并检测PI发射的荧光强度。每个样品进行3次平行实验，检测时至少收集10 000个细胞核。

1.3   数据分析

使用FACSTM 1.0.0.650 软件对流式细胞仪的测定结果进行作图分析，获得观赏海棠样品的峰值直方图。以CV值（DNA峰的变异系数）的大小作为评价流式测定结果好坏的参数，一般CV值小于5.0%，实验结果才具可信度^[18]。将符合条件的实验结果进行DNA含量计算，单位为pg或Mbp（1 pg DNA=978 Mbp）^[8]。DNA含量计算公式为：待测样本DNA含量=内标样本DNA含量（2.4 Gb）×（待测样本峰荧光强度/内标样本峰荧光强度）。采用SPSS 20.0软件对测定结果进行统计与方差分析。

2.   结果与分析

2.1   解离液与内参的筛选

本研究分别以玉米品种‘B73’、大豆（Glycine max （L.）Merr.）、楸子（Malus prunifolia （Willd.） Borkh.）、水稻（Oryza sativa sub. Japonica）品种‘Nipponbare’和待测样品观赏海棠品种‘皇家雨点’的嫩叶为实验材料，依次单独上机测试，逐个比较Tris-MgCl₂、LB01、mGb和 Galbraith's 4种解离液的裂解效果（表2）。逐一对比后发现，mGb解离液在3种内参（玉米、楸子、水稻）和观赏海棠中表现最佳，其CV值均小于5%；而另外3种解离液（Tris-MgCl₂、LB01、Galbraith's）在大豆、楸子、水稻和观赏海棠实验分析中，CV值均大于5%。此外，研究结果表明，玉米在4种解离液中解离效果均表现良好，而待测样品观赏海棠仅在mGb解离液中解离效果较为理想。故本研究最终选用mGb作为观赏海棠C值测定的解离液。

表  2  几种常用解离液对样品的处理效果对比

Table  2.  Comparison in using different isolation buffers to deal with samples

物种 Species	mGb解离液 mGb buffer	Tris-Mgcl2解离液 Tris-Mgcl2 buffer	LB01解离液 LB01 buffer	Galbraith’s解离液 Galbraith’s buffer
玉米Zea mays L. cv.‘B73’	CV<4%	CV<5%	CV<5%	CV<5%
大豆Glycine max （L.）Merr.	CV<6%	CV<5%	CV<5%	CV<6%
楸子Malus prunifolia （Willd.） Borkh.	CV<5%	CV<6%	CV<6%	CV<8%
水稻Oryza sativa subsp. japonica cv.‘Nipponbare’	CV<5%	CV<8%	CV<5%	CV<5%
观赏海棠‘皇家雨点’Malus ‘Royal Raindrop’	CV<3%	CV<6%	CV<6%	CV<8%
注：CV表示变异系数。
Note: CV represents coefficient of variation.

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使用mGb解离液分别制备4种内参与观赏海棠混和后的细胞核悬液，上样检测结果显示，大豆、水稻、楸子作为内参时，杂峰多，峰图效果不理想，且CV值大于5%（图1：A~C），实验结果不佳。而使用玉米作为内参后颗粒收集速度较快，且颗粒聚集度好，检测结果中杂峰少，峰形佳，CV值在5%以内（图1：D）。因此本研究选用玉米作为内参测定观赏海棠基因组大小。

2.2   观赏海棠基因组大小的测定

以玉米‘B73’为内标，采用内标法对观赏海棠DNA含量进行测定，待测样品与内标同时进行检测。流式检测结果如图2所示，标样与待测样的主峰区分度较好，峰较为清晰，且CV值都在5.0%以下，说明使用玉米‘B73’做内参样本具有准确性和可靠性。

选择的内参样本玉米DNA含量为2.4 Gb，根据两峰的荧光强度对比，参照玉米‘B73’的峰值及基因组大小计算出观赏海棠各品种的基因组大小（表3）。结果发现，18份观赏海棠品种C值大小为0.74~1.50 pg，平均为0.96 pg。其中，‘玛丽波特’C值最大，达到1.50 pg，基因组大小为1 467.00 Mbp；其次为‘蒂娜’，C值为1.28 pg，基因组大小为1 251.84 Mbp；‘红哨兵’和‘紫王子’C值相同，均为0.91 pg，基因组大小为889.98 Mb；‘红珠宝’C值最小，为0.74 pg，基因组大小为723.72 Mb。差异显著性分析结果表明，18个观赏海棠品种间C值大小存在明显差异。

表  3  观赏海棠样品流式细胞术测定结果

Table  3.  Results of flow cytometry of ornamental Malus spp. samples

序号 Code	品种名 Cultivars	内参平均荧光强度 Average internal reference fluorescence intensity	待测样品平均荧光强度 Average samples to be tested fluorescence intensity	平均DNA指数 Mean DNA index	1C值 1C value / pg	基因组大小 Genome size / Mbp
1	‘春之韵’	89 268	46 030	0.52	1.26±0.01b	1 232.28
2	‘蒂娜’	105 605	55 412	0.52	1.28±0.02b	1 251.84
3	‘范艾斯汀’	129 051	45 702	0.35	0.87±0.01e	850.28
4	‘高原红’	127 654	45 673	0.36	0.85±0.02ef	831.30
5	‘红哨兵’	136 645	50 094	0.37	0.91±0.01d	889.98
6	‘红衣主教’	100 646	49 065	0.49	1.18±0.01c	1 154.04
7	‘红珠宝’	139 821	42 288	0.30	0.74±0.01i	723.72
8	‘皇家雨点’	127 846	45 916	0.36	0.85±0.02efg	831.30
9	‘黄金甲’	132 992	42 776	0.32	0.75±0.02i	733.50
10	‘灰姑娘’	121 731	40 875	0.34	0.82±0.01gh	806.21
11	‘火鸟’	92 371	44 177	0.48	1.16±0.01c	1 134.48
12	‘金丰收’	136 737	47 981	0.35	0.86±0.01ef	842.51
13	‘金雨滴’	138 446	47 158	0.34	0.85±0.01fg	831.30
14	‘玛丽波特’	77 819	47 948	0.62	1.50±0.01a	1 467.00
15	‘美果海棠’	160 637	53 281	0.33	0.82±0.01gh	801.96
16	‘时光秀’	137 232	44 652	0.33	0.81±0.01h	792.18
17	‘斯普伦格’	152 962	50 215	0.33	0.80±0.01h	782.40
18	‘紫王子’	123 844	45 587	0.37	0.91±0.02d	889.98
注：每个样品设3次重复；表中数据为平均值±标准误；1C值栏中数据后的不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 Notes: Three replicates for each sample; data in table are average values±SD; Different lowercase letters after the data in the 1C value column indicate significant difference(P<0.05).

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2.3   苹果属植物的基因组大小对比分析

将C值数据库中已收录的所有苹果属观赏海棠种质资源与本实验中的观赏海棠品种进行对比分析后发现，C值数据库中已收录的观赏海棠1C值大小范围为0.62~2.30 pg，基因组大小为610.05~2 254 Mbp，平均值为1.01 pg。本研究中观赏海棠品种1C值测定为0.74~1.50 pg，基因组大小为726.16~1 467.00 Mbp，在已收录的C值大小浮动范围内，平均值为0.96 pg（图3）。

图  3  苹果属植物的基因组大小对比分析

A：C值数据库已收录的苹果属观赏海棠的1C值大小；B：本实验苹果属观赏海棠的1C值大小。

Figure  3.  Comparative analysis of genome size in Malus

A: 1C value of the ornamental Malus that has been included in the C-value database; B: 1C value of the ornamental Malus in this experiment.

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3.   讨论

核DNA数量和基因组大小是生物多样性的重要特征，具有重要的生物学意义。目前由于技术性原因致使观赏海棠在这方面的研究较少。故本研究对比不同解离液对观赏海棠细胞的解离效果，建立基于流式细胞术的观赏海棠基因组大小测定方法。测定的18个观赏海棠品种基因组大小范围为726.16~1 467.00 Mbp，C值大小范围为0.74~1.50 pg，品种间存在显著差异。此次测定的18个观赏海棠品种的C值均为首次报道，不仅丰富了苹果属植物的C值数据库，同时还可为苹果属植物基因组大小的测定提供技术参考。

流式细胞术是一种对悬浮的单细胞进行高速分析和分选的技术，是目前最为常用的测定植物细胞核DNA含量的方法^[14]。其测定方法主要有两种，即内参法和外参法。内参法的优势在于它能避免因样品不一致，仪器不稳定而引起的误差。但是选择内参法检测细胞核DNA含量必须具备以下条件，即选择的内参细胞核DNA含量必须是已知的，并且能够维持一定的稳定性，同时要接近待测样本的DNA含量，且内参样本的峰值与待测样本的G2或M期峰值不重叠^[15]。目前较常用的植物内参有豌豆（Pisum sativum L.）^[15]、番茄（Solanum lycopersicum L.）^[16]、玉米‘B73’^[16]、大豆^[17]等。本研究在预实验中发现待测观赏海棠材料基因组大小差异较大，最大的基因组在1 Gb左右。本研究分别以玉米、大豆、楸子和水稻为待选内标，多次测试结果均显示玉米‘B73’（参考基因组为2.4 Gb）能与所有的待测样品完全分开，与内参样品的G2和M期峰值不重叠，因此选定玉米‘B73’作为内参，测定18种观赏海棠DNA含量。

流式细胞术分析实验的成功与否受很多方面影响，具体包括：植物组织、解离液的选择以及叶片的成熟度和保存方式等^[18-21]。其中，解离液的选择是FCM 检测实验成功的关键因素，需要利用适合的解离液分离出完整的细胞核，并使用 PI染料成功将其染色^[22-25]。到目前为止，没有任何一种解离液适用于所有植物的细胞核分离。因此在进行流式细胞术分析时，首先需要进行解离液的筛选，得到最佳的细胞核悬浮液后进行后续的染色与上机检测实验。同时，为保证实验结果的可信度，需要根据DNA含量变异系数（CV值）进行判断，CV值越小，DNA含量分析就越准确。当CV值<5%时，被视作实验结果可靠^[18]。本研究采用4种常见的解离液处理观赏海棠样品和内参样品玉米‘B73’，最终选定了解离效果最佳的mGb解离液。实验结果表明，玉米‘B73’与各样品的测定峰区分良好，且CV值均控制在5%以内，表明实验结果稳定可靠。本实验的解离液筛选和内参选择可为今后苹果属物种的流式细胞术分析提供基础。

C值数据库中查询到共有73份观赏海棠的C值数据已被收录，其1C值大小范围为0.62~2.30 pg。本研究中测定的18个观赏海棠品种的1C值大小为0.74~1.50 pg，在已收录的C值大小浮动范围内，说明本研究结果是准确且可靠的。此外，研究表明，同一类群中，物种的DNA C值与倍性水平呈正相关，即C值随着倍性的增加而增大^[19]。在已测定的73份苹果属观赏海棠中，二倍体植物的基因组大小范围为610.05~833 Mb，而多倍体植物基因组大小的范围为1 039.29~1 564.57 Mb，进而推断18个观赏海棠品种中‘火鸟’、‘红衣主教’、‘春之韵’、‘蒂娜’和‘玛丽波特’（基因组大小为1 134.48~1 467.00 Mb）为多倍体，其他13个观赏海棠品种均为二倍体（基因组大小为723.72~889.98 Mb）。本课题组此前的常规染色体压片镜检实验（数据未发表）证实了此推测。同时也表明了流式细胞术在测定植物C值大小和推断倍性时是准确的。

4.   结论

综上，本研究以玉米‘B73’为内标，利用mGb解离液制备细胞核悬液，采用流式细胞术对18个观赏海棠品种的基因组大小进行测定。测得其基因组大小为726.16~1 467.00 Mbp（平均值为936.04 Mbp），且18个观赏海棠品种间基因组大小存在显著差异。该研究结果可为开展苹果属植物的基因组测序、基因组文库建立以及系统进化研究等工作提供参考。