Construction of two-hybrid library of yeast and screening of NnWRKY40 interacting proteins in Nelumbo nucifera Gaertn. ‘Baihuajian’
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摘要:
通过构建莲（Nelumbo nucifera Gaertn.）品种 ‘白花建’不同组织的混合cDNA文库，筛选与莲转录因子NnWRKY40互作的蛋白，探究NnWRKY40参与调控次级代谢物生物碱合成的可能机制。结果显示，混合cDNA文库的库容为1.2 × 107 CFU，重组率为100%，插入片段平均长度大于1000 bp。NnWRKY40包含两个同源基因NnWRKY40a和NnWRKY40b，利用NnWRKY40b构建诱饵载体pGBKT7-NnWRKY40b，通过共转化方法，从文库中筛选到27个与NnWRKY40b 互作的蛋白。这些互作蛋白可分为生长发育及抗逆、激素调控和次级代谢、未知蛋白3类。选取6个代表性互作蛋白（NnUBC、NnPEBP、NnPPOA、NnCHS、NnJAZ1和Unknown protein 3）进行一对一验证，发现其中JAZ蛋白与次生代谢物生物碱合成相关，提示NnWRKY40b转录因子可能与茉莉酸（JA）介导的生物碱合成调控密切相关。
Abstract:To explore the potential mechanism of the NnWRKY40 transcription factor in lotus (Nelumbo nucifera Gaertn.) for regulating the synthesis of secondary metabolite alkaloids, a mixed cDNA library from different lotus tissues was constructed, and the proteins interacting with NnWRKY40 were screened. Total RNA of different tissues was extracted from ‘Baihuajian’, and a mixed cDNA library was established. The library capacity was 1.2 × 107 CFU, recombinant rate was 100%, and average length of the inserted fragments was >1 000 bp. NnWRKY40 contains two homologous genes, NnWRKY40a and NnWRKY40b. As NnWRKY40b is reported to play a leading role in transcriptional activation of alkaloid synthesis genes, we used NnWRKY40b to construct the bait vector PGBKT7-NnWRKY40b. In total, 27 proteins interacting with NnWRKY40b were screened from the library using the co-transformation method. These interacting proteins could be divided into three categories: i.e., growth and development and stress response, hormone regulation and secondary metabolism, and unknown proteins. Six representative proteins, including NnUBC, NnPEBP, NnPPOA, NnCHS, NnJAZ1, and unknown protein 3, were selected for one-to-one verification, among which the JAZ protein was associated with alkaloid synthesis, suggesting that the NnWRKY40b transcription factor may be closely related to jasmonic acid (JA)-mediated regulation of alkaloid synthesis in N. nucifera.
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Keywords:
- Nelumbo nucifera /
- Yeast two-hybrid /
- NnWRKY40 /
- Protein interaction
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莲（Nelumbo nucifera Gaertn.）是一种莲属多年生水生草本植物，在我国广泛种植。除了观赏及食用价值外，莲还富含珍贵的药用成分生物碱，包括荷叶碱、N-去甲基荷叶碱（N-nornuciferine）、O-去甲基荷叶碱（O-nornuciferine）、莲心碱等[1]。研究表明，莲生物碱具有降脂减肥[2]、抗菌[3]、抗癌[4]等药理作用。然而，莲生长周期较长，目标生物碱含量低，且易受环境影响，这些因素极大地限制了生物碱的获取和应用。近年来，研究发现转录因子（包括AP2/ERFs、bHLH、MYB、WRKY）在植物次生代谢过程中具有显著的调控作用[5-11]，说明转录因子调控植物药用活性成分合成的重要性及利用转录因子增加目标产物的可行性。
植物转录因子种类繁多，其中WRKY家族近年来研究较为广泛，是存在于高等植物中的一类转录因子[12] 。该家族成员的结构特点是含有保守的WRKYGQK序列以及特定的锌指结构，并且能特异地结合到目标基因启动子的W-box （(T)(T)TGAC(C/T)）位点从而启动该基因的转录[12] 。植物中第一个WRKY转录因子是由Ishiguro 和Nakamura[13]在甘薯（Ipomoea batatas （L.）Lam.）中发现。随着研究的深入，科学家相继在拟南芥（Arabidopsis thaliana （L.）Heynh.）、烟草（Nicotiana tabacum L.）、欧芹（Petroselinum crispum （Mill.）Fuss）、水稻 （Oryza sativa L.）、长春花（Catharanthus roseus （L.）G. Don）、罂粟（Papaver somniferum L.）、大麻（Cannabis sativa L.）等植物中发现了WRKY转录因子，而WRKY转录因子的调节功能也逐步成为研究热点[12, 14-19]。
前人研究最多、最广的是WRKY转录因子在调节植物生长发育、衰老以及抗生物及非生物胁迫中的作用。然而，WRKY在植物次生代谢中的调控作用研究相对较少。Suttipanta等[7]发现长春花中萜类吲哚生物碱（Terpene indole alkaloid，TIA）合成关键基因色氨酸脱羧酶基因（TDC）受到CrWRKY1转录因子的调控，进而影响TIA的生物合成。黄连（Coptis japonica（Thunb.）Makino）中CjWRKY1是苄基异喹啉生物碱（Benzylisoquinoline alkaloid，BIA）合成途径中第一个被发现的WRKY转录因子，该转录因子能调控黄连素合成途径中8个合成酶基因（NCS、6OMT、CNMT、CYP80B2、4’OMT、BBE、SMT、CYP719A1）的表达[6]。另外，WRKY转录因子是调节罂粟中BIA合成最具代表性的一类转录因子， PsWRKY转录因子可以结合到酪氨酸脱羧酶基因（TYDC）的启动子区域，从而调节BIA的积累[8,20]。值得注意的是，WRKY转录因子调控次生代谢物的合成和积累时，通常与植物激素相关[21, 22]。如长春花CrWRKY1和黄连CjWRKY1均能响应茉莉酸（Jasmonic acid，JA）信号分子并通过JA介导的信号途径来调控TIA与BIA的合成[6, 7]。外源茉莉酸甲酯（Methyl-jasmonate，MeJA）可诱导罂粟中PsWRKY基因的表达，并参与调控BIA的合成[20]。另外，在黄瓜（Cucumis sativus L.）中，JA可上调关键转录因子WRKY基因表达量，增加萜类葫芦素的含量[21]。除JA及其衍生物外，水杨酸（Salicylic acid，SA）、脱落酸（Abscisic acid，ABA）等激素均能通过调控转录因子如MYB、AP2/ERFs、bHLH、MYC、WRKY的表达，进而影响植物次级代谢物合成酶的活性，且这3种激素能协同调控植物的次生代谢过程[22-24]。
水生植物莲，因其基因组信息出现较晚，转录因子调控莲中生物碱合成的研究也相对滞后。2013年，国内外科学家初步完成了中国古代莲的基因组测序工作[25]；2020年，研究者又进一步完善了该成果[26]。这些数据为我们进行荷叶碱合成相关调控因子的筛选提供了契机。本课题组前期的工作发现莲NnWRKY40转录因子与荷叶碱的合成显著相关，NnWRKY40包含的两个同源基因NnWRKY40a、NnWRKY40b，对荷叶碱合成酶基因均有转录激活作用，其中NnWRKY40b基因起主导作用[27]。因此，本研究以NnWRKY40b为研究对象，通过构建‘白花建’莲不同组织部位的cDNA文库，筛选与NnWRKY40b转录因子互作的蛋白，以期为揭示NnWRKY40b参与调控生物碱合成的分子机制研究奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 植物RNA提取
实验所用植物材料‘白花建’莲来源于武汉理工大学荷花种植基地。收集莲不同组织（卷叶、大叶、未膨大的地下茎、膨大的地下茎、叶柄、花蕊）样品，采用CTAB抽提法提取总RNA，用于后续文库构建。
1.2 cDNA初级文库构建
按照CloneMiner说明书，取上述步骤得到的mRNA合成双链cDNA，将双链cDNA与三框attB1重组接头连接，收集再次分级分离的cDNA，用BP Clonase® Ⅱ enzyme 连接纯化后的cDNA与pDONR222载体。连接产物电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，涂布平板用于库容量鉴定。取转化后细菌原液10 uL稀释100倍后，从中取出50 uL涂布LB平板（含卡那霉素），第2 d计数并鉴定库容量。计数方法为：CFU/mL = 平板上的克隆数/50 uL × 1000倍 × 1 × 103 uL，文库总CFU = CFU/mL × 文库菌液总体积（mL）。随机挑取24个克隆进行菌落PCR，鉴定其插入片段长度和重组率。
1.3 次级文库构建
将上步验证合格的初级文库，采用肉汤培养基，摇菌，30 ℃过夜培养。从菌液中抽提质粒并电泳检测。取检测过的质粒稀释到300 ng/uL，与pGADT7-DEST载体用LR反应进行连接，连接产物电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，即可获得次级文库菌液。稀释菌液鉴定库容量，挑取单菌落鉴定重组率和插入片段长度。检测合格的次级文库提取质粒，用于后续酵母双杂共转化。
1.4 诱饵载体PGBKT7-NnWRKY40b的构建
设计引物扩增NnWRKY40b基因CDS序列（表1），并交由上海生工生物工程公司合成。以Synthesis SuperMix试剂盒反转录合成的cDNA为模板扩增NnWRKY40b基因，用DNA产物纯化试剂盒回收、纯化PCR产物。利用同源重组克隆法将NnWRKY40b基因无缝连接至诱饵载体pGBKT7中，连接产物转化大肠杆菌，均匀涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基，倒置过夜培养，挑取阳性单克隆，经菌落 PCR验证正确后送公司测序。
表 1 互作蛋白点对点验证所用引物Table 1. Primers used in one-to-one verification of interacting proteins引物名
Primer name正向序列（5′–3′）
Sequence of forward primer反向序列（5′–3′）
Sequence of reverse primerpGBKT7-NnWRKY40b CATGGAGGCCGAATTCATGGAGTC
GACTTGGTTGGATACGCAGGTCGACGGATCCTCACCA
TTTCTGCACTGTTGAATGpGADT7-NnJAZ1 CAGATTACGCTCATATGATGTCAA
GAGCGCCGGACCTTGCTTGGGTGGAATTCCTACTGT
GGAGATCGAGCTTGTpGADT7-NnUBC CAGATTACGCTCATATGATGGCGA
ACAGCAATCTACCCTGCTTGGGTGGAATTCTCAGGCA
CCACTTGCATATAGpGADT7-NnCHS CAGATTACGCTCATATGATGGTGA
CCGTGGAAGACATCTGCTTGGGTGGAATTCCTAGGCA
GCGATACTGTGAAGpGADT7-NnPEBP CAGATTACGCTCATATGATGGCGA
GTGACGAGTTTAGGTTGCTTGGGTGGAATTCTTAGGCT
GGGAAAAGTCGGATCpGADT7-NnPPOA CAGATTACGCTCATATGATGGCA
TCGCTTTCTCCCTTGATGCTTGGGTGGAATTCTCACGAA
GCGAACACTATCTTGpGADT7-Unknown protein3 CAGATTACGCTCATATGATGCAT
TCCCTGAGCTTAAAACTTGCTTGGGTGGAATTCTTAGACG
ATATCCGTATCATCTC1.5 诱饵重组质粒毒性检测和自激活检测
制备Y2H Gold酵母感受态细胞，将诱饵载体pGBKT7-NnWRKY40b与空白猎物载体pGADT7共转化到感受态细胞。加入1 mL 0.9% NaCl重悬菌体，取150 μL 涂布于DDO（SD/-Leu/-Trp）、TDO（SD/-Leu/-Trp/-His）、QDO（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade）平板上，30 ℃培养箱培养4 ~ 5 d，观察菌斑生长情况。
1.6 转录因子NnWRKY40b互作蛋白筛选
将cDNA文库质粒和诱饵质粒pGBKT7-NnWRKY40b共转化Y2H Gold酵母感受态细胞，将菌液按200 μL/板涂布50个150 mm TDO/X（SD/-Leu/-Trp/-His/X-α-gal）平板，30 ℃倒置培养3 ~ 5 d。将直径大于2 mm的菌落全部转接至新的QDO/X（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal）平板上增大筛选压力，30 ℃倒置培养3 d。阳性克隆菌株分别接入QDO 液体培养基，振荡培养过夜后采用酵母小量抽提试剂盒抽提酵母质粒。以猎物质粒PGADT7的通用引物，进行PCR扩增鉴定。鉴定的克隆送上海生工测序并对返回序列进行生物信息学分析。
1.7 互作蛋白的激素响应分析
在莲叶生长的第4阶段（S4时期：叶片未完全展开，叶边缘呈卷曲状），于叶片表面喷洒0.1 mmol/L 茉莉酸甲酯（MeJA）或 5 mmol/L 水杨酸（SA）（均含 0.02% Silwet L77）。分别于处理 0、3、6 及 24 h 后收集样品，每个时间点的样品设置3个生物学重复。样品进行转录组测序，分析互作蛋白对激素的响应。
1.8 代表性互作蛋白点对点验证
制备新鲜的酵母感受态细胞，将代表性互作蛋白的编码基因全长CDS作为猎物克隆到pGADT7载体中，与pGBKT7-NnWRKY40b共转化。同时，将BD-53 + AD-T和BD-Lam + AD-T组合分别作为阳性及阴性对照进行共转化。共转化酵母涂布于DDO（SD/-Leu/-Trp）培养基上进行转化选择。对于互作分析，酵母涂布于TDO（SD/-Leu/-Trp/-His）培养基上，30 ℃倒置培养3 ~ 5 d，分析结果。引物序列见表1。
2. 结果与分析
2.1 莲组织总RNA的提取及mRNA的分离
本研究提取‘白花建’莲卷叶、大叶、地下茎（未膨大）、地下茎（膨大）、叶柄和花芯6种组织的总RNA，电泳检测其质量（图1：A）。结果显示，各组织总RNA完整性好，质量满足实验要求，可进行后续分离纯化得到mRNA（图1：B）。如图1：B所示，无明显28S和18S rRNA 条带，该mRNA可用于后续合成双链cDNA。
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图 1 ‘白花建’莲6个不同组织样品总RNA质检（A）和mRNA分离结果（B）Figure 1. Total RNA quality testing of six different tissue samples of 'Baihuajian' (A) and mRNA isolation (B)2.2 初级文库的构建与鉴定
加接头的双链‘白花建’cDNA与pDONR222载体连接后，转入大肠杆菌感受态细胞中。取10 uL转化后的细菌原液稀释100倍，从中取出50 uL涂布LB平板（含卡那霉素）。结果显示，平板中生长单菌落大于1500个，初级文库库容量为1.2 × 107 CFU（图2：A）。随机挑取24个单菌落进行PCR扩增，电泳结果表明重组率为100%，平均插入片段长度大于1000 bp（图2：B），推断所构建初级文库成功，可用于后续实验。
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图 2 初级文库库容鉴定（A）和24个克隆中插入片段的PCR鉴定（B）Figure 2. Identification of primary library capacity (A) and PCR identification of inserts (B)2.3 次级文库构建与鉴定
抽提初级文库质粒，与pGADT7-DEST载体用LR反应进行连接并电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，得到次级文库菌液。取10 uL转化后菌液稀释100倍后取出50 uL涂布LB平板（含氨苄青霉素）。结果显示，平均单菌落数大于1700个，次级文库容量为1.36 × 107 CFU（图3：A）。随机挑取24个单菌落进行PCR扩增，重组率为100%（图3：B），平均插入片段长度大于1000 bp。结果表明次级文库构建成功。
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图 3 次级文库库容鉴定(A)和24个克隆中插入片段的PCR鉴定(B)Figure 3. Identification of secondary library capacity (A) and PCR identification of inserts (B)2.4 诱饵质粒毒性检测与自激活检测
将诱饵质粒PGBKT7-NnWRKY40b和猎物空载PGADT7共转化Y2H Gold酵母感受态细胞，涂布于DDO（SD/-Trp/-Leu）、TDO（SD/-Trp/-Leu/-His）、QDO（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade）缺陷型培养基上，30 ℃培养箱培养3 d。结果发现，只有DDO平板上有转化酵母生长，说明重组诱饵质粒成功转入宿主菌且对宿主菌无毒性（图4：A）。另外，在TDO和QDO平板未发现转化酵母生长（图4：B、C），说明没有激活报告基因HIS3和ADE2，诱饵NnWRKY40b转录因子无自激活活性，可进行后续双杂交筛选。
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图 4 pGBKT7-NnWRKY40b 诱饵蛋白自激活检测Figure 4. Self-activation test of pGBKT7-NnWRKY40b bait protein2.5 NnWRKY40b转录因子互作蛋白筛选
将cDNA文库质粒和诱饵质粒pGBKT7-NnWRKY40b共转化Y2H Gold酵母感受态细胞，菌液按200 uL/板涂布于TDO/X （SD/-Leu/-Trp/-His/X-α-gal）平板，30 ℃倒置培养3 ~ 5 d，得到蓝色菌落（图5：A）。将直径大于2 mm的菌落全部转接至新的QDO/X（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/ X-α-gal）平板上增大筛选压力，30 ℃倒置培养3 d，得到44个候选互作蛋白（图5：B）。测序后删除重复序列，最终获得27个互作蛋白（表2）。
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图 5 TDO/X（A）和QDO/X（B）选择性培养基筛选的NnWRKY40b互作蛋白Figure 5. NnWRKY40b interacting proteins screened by TDO/X (A) and QDO/X (B) selection medium表 2 NnWRKY40b互作蛋白筛选及其功能预测Table 2. Screening and functional prediction of NnWRKY40b interacting proteins分类
Classification蛋白号
Protein ID基因号
Gene ID蛋白名称
Protein name相关蛋白功能预测
Protein function prediction生长发育及
抗逆XP_010271938.1 LOC104607876 枯草杆菌蛋白酶，NnSBT1.7 种皮发育相关 XP_010266914.1 LOC104604316 质体蓝素，NnPC2B 参与光合作用 XP_010279114.1 LOC104613113 泛素结合酶，NnUBC DNA修复，光周期，抗逆胁迫响应，降解生长素，延缓植物衰老，调控ABA信号途径 YP_009093956.1 LOC20834983 ATP合成酶CF1亚基，NnatpE 光合作用，细胞代谢 XP_010265991.1 LOC104603626 类似谷胱甘肽S-转移酶U17, NnGST 抗逆反应，植物修复 XP_010269750.1 LOC104606314 铜转运蛋白5.1，NnCTR5.1 光合作用，呼吸作用，细胞壁代谢，氧化应激反应 XP_010255313.1 LOC104596029 非依赖性蛋白转位酶蛋白，NnTATB 细胞内运输、分泌和囊泡转运 XP_010248208.1 LOC104591115 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶激活酶，NnRCA 光合作用，叶片衰老，响应非生物胁迫 XP_010270928.1 LOC104607108 半胱氨酸过氧化物氧还蛋白，NnPER1 细胞氧化还原稳态，细胞氧化剂解毒 XP_010269352.1 LOC104606034 60S核糖体蛋白L13e，NnRPL13 翻译、核糖体结构与生物发生 XP_010270872 LOC104607076 ADP-核糖基化因子，NnBLH8 细胞内运输、分泌和囊泡转运 XP_010275748.1 LOC104610704 核糖核酸酶，NnCAF 1 RNA降解 XP_010241640.1 LOC104586181 液泡蛋白分选相关蛋白，NnVPS37-1 盐胁迫响应 XP_010264580.1 LOC104602549 磷脂酰乙醇胺结合蛋白，NnPEBP 植物生长发育，几种信号通路的调节，如MAP激酶通路 XP_010251283.1 LOC104593218 类似Fcf2蛋白，NnFcf 胚成熟，花瓣分化，叶片衰老 XP_010263125.1 LOC104601478 ATP合成酶, NnatpH 光合作用，细胞代谢 XP_010244725.1 LOC104588480 类ACR12蛋白，NnACR12 光合电子传递，冷响应，光响应 激素调控和
次级代谢XP_010258950.1 LOC104598530 泛素蛋白，NnUBQ 蛋白降解，茉莉酸信号途径，细胞周期 XP_010251469.1 LOC104593386 类似TIFY 10A蛋白，NnJAZ1 抑制JA信号传导，响应盐胁迫，
花的发育，茎叶的发育NP_001305084.1 LOC104602160 查尔酮合成酶，NnCHS 类黄酮的生物合成，生长素运输的调节，根系向重力性的调节 XP_010273014.1 LOC104608661 DAHP合成酶，NnDAHP 分支酸合成 ADC92563.1 LOC104588895 多酚氧化酶，NnPPOA 类黄酮、木质素、原花青素生物合成过程 XP_010270953.1 LOC104607120 S-腺苷甲硫氨酸合酶5，NnSAMS 木质素生物合成过程，蛋氨酸代谢过程，冷反应 未知 XP_010261469.1 LOC104600297 未表征蛋白1 未知 XP_010260316.1 LOC104599465 未表征蛋白2 未知 XP_010248518.1 LOC104591415 未表征蛋白3 未知 XP_010276554.1 LOC104611264 未表征蛋白4 未知 利用NnWRKY40b转录因子作为诱饵初步筛选出27个候选互作蛋白（表2）。通过功能注释和分类，27个候选互作蛋白可分为3大类，包括17个生长发育及抗逆相关蛋白、6个激素调控和次级代谢相关蛋白以及4个未命名蛋白。
2.6 互作蛋白编码基因响应激素JA、SA的表达分析
由于WRKY转录因子调控植物次级代谢物积累通常与激素相关，因此，我们检测了NnWRKY40b基因以及互作蛋白编码基因响应激素JA和SA的表达谱。根据转录组数据得到NnWRKY40b基因和27个互作蛋白编码基因表达热图（图6）。其中，NnWRKY40b能快速响应激素处理，说明NnWRKY40b可能参与激素介导的莲各种生理过程。JA处理3 h时，27个候选互作蛋白编码基因中有6个基因显著上调（log2FC ≥ 1），6个基因显著下调（log2FC ≤ −1），说明这12个基因能快速响应激素JA，可能参与JA介导的信号通路。另外，分别有8个和10个基因在JA处理6 h和24 h时被显著诱导（图6：A）。与JA处理相比，激素SA处理后，27个候选互作蛋白编码基因中有10个基因表达量呈先上升后下降的趋势，且在处理24 h时回到本底或者下调表达。另外，有8个基因在SA处理24 h后显著上调，说明这些基因可能位于SA介导的信号通路下游。除此以外，激素SA对10个候选基因有一定抑制作用，特别是处理6 h时较为显著（图6：B）。
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图 6 NnWRKY40b和互作蛋白编码基因在激素JA（A）、SA（B）处理下的表达谱Figure 6. Expression profiles of genes encoding NnWRKY40b and interacting proteins under JA (A) and SA (B) treatments2.7 代表性互作蛋白与NnWRKY40b点对点验证
为了进一步验证候选蛋白与NnWRKY40b互作的准确性，本研究选取了6个代表性候选蛋白进行点对点验证（图7）。6个代表性候选蛋白包括激素调控和次级代谢相关蛋白NnPPOA、NnCHS、NnJAZ1；生长发育及抗逆相关蛋白NnUBC、NnPEBP 以及1个未知功能蛋白Unknown protein3（UNK pro3）。结果显示，NnWRKY40b转录因子能与NnPPOA、NnCHS、NnJAZ1蛋白互作（图7：A），NnPPOA与NnCHS蛋白是植物合成类黄酮过程中的重要酶类[28-30]，NnWRKY40b能与二者互作，说明NnWRKY40b可能参与调控植物类黄酮的合成。另外，NnJAZ1是JA信号通路中重要调控因子，能参与介导植物次生代谢物合成[31]。NnWRKY40b与NnJAZ1互作，说明NnWRKY40b转录因子可能与JA介导的调控植物次级代谢过程显著相关。除了次级代谢和激素相关蛋白，NnWRKY40b还能与NnUBC（泛素结合酶）和NnPEBP（磷脂酰乙醇胺结合蛋白）互作（图7：B），表明NnWRKY40b可能参与植物生长发育过程的调控。
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图 7 NnWRKY40b和次级代谢相关蛋白（A）以及生长发育相关蛋白和未知功能蛋白的互作（B）Figure 7. NnWRKY40b interactions with secondary metabolism-related proteins (A) and growth and development-related and unknown proteins (B)3. 讨论
莲是一种药食两用的水生植物，其药理作用的活性成分主要来源于莲次生代谢物——生物碱。通过前期转录组数据分析发现，NnWRKY40转录因子与莲生物碱合成密切相关。NnWRKY40基因包含的两个同源基因NnWRKY40a和NnWRKY40b对荷叶碱合成酶基因均有转录激活作用，但NnWRKY40b的激活作用更显著[27]。因此，本研究以NnWRKY40b转录因子为研究对象，构建诱饵重组质粒，从‘白花建’莲不同组织部位的cDNA文库中筛选与其互作的蛋白，试图揭示NnWRKY40b转录因子调控莲次级代谢物合成的可能机制。
本研究成功构建了莲不同组织混合物的cDNA文库，其库容为1.2 × 107 CFU，重组率为100%，插入片段平均长度大于1000 bp。筛库结果显示27个蛋白能与NnWRKY40b相互作用。这27个候选蛋白可分为3大类，包括生长发育及抗逆、激素调控和次级代谢以及未知功能蛋白。其中，生长发育及抗逆相关候选蛋白包含17个，主要涉及植物种子发育、花分化、衰老、光合和呼吸作用、氧化应激以及非生物胁迫响应过程。点对点验证结果进一步表明，NnWRKY40b能与代表性候选蛋白NnUBC、NnPEBP互作，NnUBC、NnPEBP蛋白在植物细胞DNA修复、光周期以及抗逆过程中发挥重要功能[32-34]。此外，拟南芥AtWRKY40是莲NnWRKY40b的同源基因，研究表明，干旱胁迫下，AtWRKY40基因突变体植株种子萌发率下降，且叶片抗氧化酶活力及脯氨酸含量显著降低[35]。AtWRKY40基因还参与调控叶绿体和线粒体功能，激活抗胁迫基因表达[36]。以上发现充分表明莲NnWRKY40b转录因子可能参与莲生长发育及抗逆过程。
除了生长发育及抗逆相关蛋白，另一类激素调控和次级代谢相关候选蛋白包含6个成员，主要涉及JA信号转导以及次级代谢物合成过程。点对点验证进一步证明NnWRKY40b与NnPPOA、NnCHS和NnJAZ1蛋白互作。其中NnPPOA和 NnCHS蛋白与植物合成次级代谢物如类黄酮、木质素及花青素有关[28-30]。另外，NnJAZ1蛋白与JA介导的信号通路有关，研究表明，JA作为一种植物激素，能诱导植物次生代谢物如生物碱的合成[31, 37]。植物体内存在一系列JA信号途径抑制因子，包括NiNJA（Novel interactor of JAZ）、TPL（Topless）、TPR（Topless-related）和JAZ等，能与JA信号通路相关转录因子结合，抑制其发挥转录激活功能。当外源施加JA时，植物细胞中E3泛素连接酶复合物SCFCOI1与JAZ蛋白结合力增加，导致JAZ蛋白泛素化，通过26S蛋白酶体途径降解，最终释放转录因子，使其与下游的次级代谢物合成基因的顺式作用元件结合，激活其表达[38, 39]。本研究中，NnWRKY40b与NnJAZ1能相互作用，且NnWRKY40b基因能响应JA处理[27]，因此推测JA响应的NnWRKY40可能通过JA信号通路调节莲生物碱合成。与此类似的研究在广藿香（Pogostemon cablin （Blanco）Benth.）中也有报道，JA响应的MYB类转录因子PatSWC4能与PatJAZ4因子相互作用，且PatSWC4转录因子能与广藿香醇合成基因PatPTS启动子区域结合，增强其转录活性。当过表达PatSWC4基因时能显著增加广藿香中广藿香醇的积累，说明PatSWC4转录因子能在JA介导的通路中正调控广藿香的合成[40]。
值得注意的是，NnWRKY40b转录因子还能与4个未知蛋白相互作用，其可能的功能还需进一步探究。目前的研究结果可以证明NnWRKY40b转录因子在JA介导的调控莲生物碱合成通路中可能发挥积极作用，后续将利用酵母单杂、瞬时表达等技术深入探讨NnWRKY40b转录因子调控生物碱合成的分子机制。
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图 1 ‘白花建’莲6个不同组织样品总RNA质检（A）和mRNA分离结果（B）
Figure 1. Total RNA quality testing of six different tissue samples of 'Baihuajian' (A) and mRNA isolation (B)
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图 2 初级文库库容鉴定（A）和24个克隆中插入片段的PCR鉴定（B）
Figure 2. Identification of primary library capacity (A) and PCR identification of inserts (B)
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图 3 次级文库库容鉴定(A)和24个克隆中插入片段的PCR鉴定(B)
Figure 3. Identification of secondary library capacity (A) and PCR identification of inserts (B)
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图 4 pGBKT7-NnWRKY40b 诱饵蛋白自激活检测
Figure 4. Self-activation test of pGBKT7-NnWRKY40b bait protein
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图 5 TDO/X（A）和QDO/X（B）选择性培养基筛选的NnWRKY40b互作蛋白
Figure 5. NnWRKY40b interacting proteins screened by TDO/X (A) and QDO/X (B) selection medium
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图 6 NnWRKY40b和互作蛋白编码基因在激素JA（A）、SA（B）处理下的表达谱
Figure 6. Expression profiles of genes encoding NnWRKY40b and interacting proteins under JA (A) and SA (B) treatments
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图 7 NnWRKY40b和次级代谢相关蛋白（A）以及生长发育相关蛋白和未知功能蛋白的互作（B）
Figure 7. NnWRKY40b interactions with secondary metabolism-related proteins (A) and growth and development-related and unknown proteins (B)
表 1 互作蛋白点对点验证所用引物
Table 1 Primers used in one-to-one verification of interacting proteins
引物名
Primer name正向序列（5′–3′）
Sequence of forward primer反向序列（5′–3′）
Sequence of reverse primerpGBKT7-NnWRKY40b CATGGAGGCCGAATTCATGGAGTC
GACTTGGTTGGATACGCAGGTCGACGGATCCTCACCA
TTTCTGCACTGTTGAATGpGADT7-NnJAZ1 CAGATTACGCTCATATGATGTCAA
GAGCGCCGGACCTTGCTTGGGTGGAATTCCTACTGT
GGAGATCGAGCTTGTpGADT7-NnUBC CAGATTACGCTCATATGATGGCGA
ACAGCAATCTACCCTGCTTGGGTGGAATTCTCAGGCA
CCACTTGCATATAGpGADT7-NnCHS CAGATTACGCTCATATGATGGTGA
CCGTGGAAGACATCTGCTTGGGTGGAATTCCTAGGCA
GCGATACTGTGAAGpGADT7-NnPEBP CAGATTACGCTCATATGATGGCGA
GTGACGAGTTTAGGTTGCTTGGGTGGAATTCTTAGGCT
GGGAAAAGTCGGATCpGADT7-NnPPOA CAGATTACGCTCATATGATGGCA
TCGCTTTCTCCCTTGATGCTTGGGTGGAATTCTCACGAA
GCGAACACTATCTTGpGADT7-Unknown protein3 CAGATTACGCTCATATGATGCAT
TCCCTGAGCTTAAAACTTGCTTGGGTGGAATTCTTAGACG
ATATCCGTATCATCTC
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表 2 NnWRKY40b互作蛋白筛选及其功能预测
Table 2 Screening and functional prediction of NnWRKY40b interacting proteins
分类
Classification蛋白号
Protein ID基因号
Gene ID蛋白名称
Protein name相关蛋白功能预测
Protein function prediction生长发育及
抗逆XP_010271938.1 LOC104607876 枯草杆菌蛋白酶，NnSBT1.7 种皮发育相关 XP_010266914.1 LOC104604316 质体蓝素，NnPC2B 参与光合作用 XP_010279114.1 LOC104613113 泛素结合酶，NnUBC DNA修复，光周期，抗逆胁迫响应，降解生长素，延缓植物衰老，调控ABA信号途径 YP_009093956.1 LOC20834983 ATP合成酶CF1亚基，NnatpE 光合作用，细胞代谢 XP_010265991.1 LOC104603626 类似谷胱甘肽S-转移酶U17, NnGST 抗逆反应，植物修复 XP_010269750.1 LOC104606314 铜转运蛋白5.1，NnCTR5.1 光合作用，呼吸作用，细胞壁代谢，氧化应激反应 XP_010255313.1 LOC104596029 非依赖性蛋白转位酶蛋白，NnTATB 细胞内运输、分泌和囊泡转运 XP_010248208.1 LOC104591115 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶激活酶，NnRCA 光合作用，叶片衰老，响应非生物胁迫 XP_010270928.1 LOC104607108 半胱氨酸过氧化物氧还蛋白，NnPER1 细胞氧化还原稳态，细胞氧化剂解毒 XP_010269352.1 LOC104606034 60S核糖体蛋白L13e，NnRPL13 翻译、核糖体结构与生物发生 XP_010270872 LOC104607076 ADP-核糖基化因子，NnBLH8 细胞内运输、分泌和囊泡转运 XP_010275748.1 LOC104610704 核糖核酸酶，NnCAF 1 RNA降解 XP_010241640.1 LOC104586181 液泡蛋白分选相关蛋白，NnVPS37-1 盐胁迫响应 XP_010264580.1 LOC104602549 磷脂酰乙醇胺结合蛋白，NnPEBP 植物生长发育，几种信号通路的调节，如MAP激酶通路 XP_010251283.1 LOC104593218 类似Fcf2蛋白，NnFcf 胚成熟，花瓣分化，叶片衰老 XP_010263125.1 LOC104601478 ATP合成酶, NnatpH 光合作用，细胞代谢 XP_010244725.1 LOC104588480 类ACR12蛋白，NnACR12 光合电子传递，冷响应，光响应 激素调控和
次级代谢XP_010258950.1 LOC104598530 泛素蛋白，NnUBQ 蛋白降解，茉莉酸信号途径，细胞周期 XP_010251469.1 LOC104593386 类似TIFY 10A蛋白，NnJAZ1 抑制JA信号传导，响应盐胁迫，
花的发育，茎叶的发育NP_001305084.1 LOC104602160 查尔酮合成酶，NnCHS 类黄酮的生物合成，生长素运输的调节，根系向重力性的调节 XP_010273014.1 LOC104608661 DAHP合成酶，NnDAHP 分支酸合成 ADC92563.1 LOC104588895 多酚氧化酶，NnPPOA 类黄酮、木质素、原花青素生物合成过程 XP_010270953.1 LOC104607120 S-腺苷甲硫氨酸合酶5，NnSAMS 木质素生物合成过程，蛋氨酸代谢过程，冷反应 未知 XP_010261469.1 LOC104600297 未表征蛋白1 未知 XP_010260316.1 LOC104599465 未表征蛋白2 未知 XP_010248518.1 LOC104591415 未表征蛋白3 未知 XP_010276554.1 LOC104611264 未表征蛋白4 未知
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[1] 陈强,张华,沙玫,刘永静. 一测多评法同时测定荷叶中4种生物碱含量[J]. 福建中医药,2020,51(6):29−32. doi: 10.3969/j.issn.1000-338X.2020.06.011 Chen Q,Zhang H,Sha M,Liu YJ. Simultaneous determination of four alkaloids in nelumbinis folium by quantitative analysis of multi-components by single marker[J]. Fujian Journal of Traditional Chinese Medicine,2020,51 (6):29−32. doi: 10.3969/j.issn.1000-338X.2020.06.011
[2] Wan Y,Xia J,Xu JF,Chen L,Yang Y,et al. Nuciferine,an active ingredient derived from lotus leaf,lights up the way for the potential treatment of obesity and obesity-related diseases[J]. Pharmacol Res,2022,175:106002. doi: 10.1016/j.phrs.2021.106002
[3] Abdallah BM,Ali EM. Green synthesis of silver nanoparticles using the Lotus lalambensis aqueous leaf extract and their anti-candidal activity against oral candidiasis[J]. ACS Omega,2021,6 (12):8151−8162. doi: 10.1021/acsomega.0c06009
[4] Tong YL,Li ZW,Wu YK,Zhu SL,Lu KK,He Z. Lotus leaf extract inhibits ER- breast cancer cell migration and metastasis[J]. Nutr Metab,2021,18 (1):20. doi: 10.1186/s12986-021-00549-0
[5] Van der Fits L,Memelink J. ORCA3,a jasmonate-responsive transcriptional regulator of plant primary and secondary metabolism[J]. Science,2000,289 (5477):295−297. doi: 10.1126/science.289.5477.295
[6] Kato N,Dubouzet E,Kokabu Y,Yoshida S,Taniguchi Y,et al. Identification of a WRKY protein as a transcriptional regulator of benzylisoquinoline alkaloid biosynthesis in Coptis japonica[J]. Plant Cell Physiol,2007,48 (1):8−18. doi: 10.1093/pcp/pcl041
[7] Suttipanta N,Pattanaik S,Kulshrestha M,Patra B,Singh SK,Yuan L. The transcription factor CrWRKY1 positively regulates the terpenoid indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus[J]. Plant Physiol,2011,157 (4):2081−2093. doi: 10.1104/pp.111.181834
[8] Agarwal P,Pathak S,Lakhwani D,Gupta P,Asif MH,Trivedi PK. Comparative analysis of transcription factor gene families from Papaver somniferum:identification of regulatory factors involved in benzylisoquinoline alkaloid biosynthesis[J]. Protoplasma,2016,253 (3):857−871. doi: 10.1007/s00709-015-0848-8
[9] Zhou ML,Memelink J. Jasmonate-responsive transcription factors regulating plant secondary metabolism[J]. Biotechnol Adv,2016,34 (4):441−449. doi: 10.1016/j.biotechadv.2016.02.004
[10] Tripathi S,Sangwan RS,Mishra B,Jadaun JS,Sangwan NS. Berry transcriptome:insights into a novel resource to understand development dependent secondary metabolism in Withania somnifera(Ashwagandha)[J]. Physiol Plant,2020,168 (1):148−173. doi: 10.1111/ppl.12943
[11] Hao XL,Xie CH,Ruan QY,Zhang XC,Wu C,et al. The transcription factor OpWRKY2 positively regulates the biosynthesis of the anticancer drug camptothecin in Ophiorrhiza pumila[J]. Hortic Res,2021,8 (1):7. doi: 10.1038/s41438-020-00437-3
[12] Eulgem T,Rushton PJ,Robatzek S,Somssich IE. The WRKY superfamily of plant transcription factors[J]. Trends Plant Sci,2000,5 (5):199−206. doi: 10.1016/S1360-1385(00)01600-9
[13] Ishiguro S,Nakamura K. Characterization of a cDNA encoding a novel DNA-binding protein,SPF1,that recognizes SP8 sequences in the 5′ upstream regions of genes coding for sporamin and β-amylase from sweet potato[J]. Mol Gen Genet,1994,244 (6):563−571. doi: 10.1007/BF00282746
[14] 向小华,吴新儒,晁江涛,杨明磊,杨帆,等. 普通烟草WRKY基因家族的鉴定及表达分析[J]. 遗传,2016,38(9):840−856. doi: 10.16288/j.yczz.16-016 Xiang XH,Wu XR,Chao JT,Yang ML,Yang F,et al. Genome-wide identification and expression analysis of the WRKY gene family in common tobacco (Nicotiana tabacum L. )[J]. Hereditas,2016,38 (9):840−856. doi: 10.16288/j.yczz.16-016
[15] Cormack RS,Eulgem T,Rushton PJ,Köchner P,Hahlbrock K,Somssich IE. Leucine zipper-containing WRKY proteins widen the spectrum of immediate early elicitor-induced WRKY transcription factors in parsley[J]. BBA-Gene Struct Expr,2002,1576 (1-2):92−100. doi: 10.1016/S0167-4781(02)00298-1
[16] 郑超,郑二松,王栩鸣,李冬月,杨勇,等. 水稻WRKY转录调控因子研究进展[J]. 生物技术通讯,2018,29(2):286−294. doi: 10.3969/j.issn.1009-0002.2018.02.026 Zheng C,Zheng ES,Wang XM,Li DY,Yang Y,et al. Research progress on rice WRKY transcription factors[J]. Letters in Biotechnology,2018,29 (2):286−294. doi: 10.3969/j.issn.1009-0002.2018.02.026
[17] 杨致荣,王兴春,薛金爱,孟令芝,李润植. 药用植物长春花WRKY转录因子的鉴定及表达谱分析[J]. 生物工程学报,2013,29(6):785−802. doi: 10.13345/j.cjb.2013.06.006 Yang ZR,Wang XC,Xue JA,Meng LZ,Li RZ. Identification and expression analysis of WRKY transcription factors in medicinal plant Catharanthus roseus[J]. Chinese Journal of Biotechnology,2013,29 (6):785−802. doi: 10.13345/j.cjb.2013.06.006
[18] Yamada Y,Nishida S,Shitan N,Sato F. Genome-wide profiling of WRKY genes involved in benzylisoquinoline alkaloid biosynthesis in California Poppy (Eschscholzia californica)[J]. Front Plant Sci,2021,2:699326.
[19] Wei HW,Chen SY,Niyitanga S,Liu T,Qi JM,Zhang LW. Genome-wide identification and expression analysis response to GA3 stresses of WRKY gene family in seed hemp (Cannabis sativa L. )[J]. Gene,2022,822:146290. doi: 10.1016/j.gene.2022.146290
[20] Mishra S,Triptahi V,Singh S,Phukan UJ,Gupta MM,et al. Wound induced tanscriptional regulation of benzylisoquinoline pathway and characterization of wound inducible PsWRKY transcription factor from Papaver somniferum[J]. PLoS One,2013,8 (1):e52784. doi: 10.1371/journal.pone.0052784
[21] He J,Bouwmeester HJ,Dicke M,Kappers IF. Transcriptional and metabolite analysis reveal a shift in direct and indirect defences in response to spider-mite infestation in cucumber (Cucumis sativus)[J]. Plant Mol Biol,2020,103 (4-5):489−505. doi: 10.1007/s11103-020-01005-y
[22] 代红洋,柏旭,李晓岗,张兴开,罗霖,等. 植物激素在三萜类化合物生物合成中的作用及调控机制研究进展[J]. 中草药,2021,52(20):6391−6402. Dai HY,Bai X,Li XG,Zhang XK,Luo L,et al. Research progress on roles of phytohormone in biosynthesis of triterpenoids and their regulatory mechanisms[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs,2021,52 (20):6391−6402.
[23] Wasternack C,Song SS. Jasmonates:biosynthesis,metabolism,and signaling by proteins activating and repressing transcription[J]. J Exp Bot,2017,68 (6):1303−1321.
[24] Yang J,Duan GH,Li CQ,Liu L,Han GY,et al. The crosstalks between jasmonic acid and other plant hormone signaling highlight the involvement of jasmonic acid as a core component in plant response to biotic and abiotic stresses[J]. Front Plant Sci,2019,10:1349. doi: 10.3389/fpls.2019.01349
[25] Ming R,VanBuren R,Liu YL,Yang M,Han YP,et al. Genome of the long-living sacred lotus (Nelumbo nucifera Gaertn. )[J]. Genome Biol,2013,14 (5):R41. doi: 10.1186/gb-2013-14-5-r41
[26] Zhang Y,Rahmani RS,Yang XY,Chen JM,Shi T. Integrative expression network analysis of microRNA and gene isoforms in sacred lotus[J]. BMC Genomics,2020,21 (1):429. doi: 10.1186/s12864-020-06853-y
[27] Li J,Xiong YC,Li Y,Ye SQ,Yin Q,et al. Comprehensive analysis and functional studies of WRKY transcription factors in Nelumbo nucifera[J]. Int J Mol Sci,2019,20 (20):5006. doi: 10.3390/ijms20205006
[28] Ferrer JL,Austin MB,Stewart C Jr,Noel JP. Structure and function of enzymes involved in the biosynthesis of phenylpropanoids[J]. Plant Physiol Biochem,2008,46 (3):356−370. doi: 10.1016/j.plaphy.2007.12.009
[29] Ren GH,Wang BJ,Zhu XD,Mu Q,Wang C,et al. Cloning,expression,and characterization of miR058 and its target PPO during the development of grapevine berry stone[J]. Gene,2014,548 (2):166−173. doi: 10.1016/j.gene.2014.07.021
[30] 王馨雨,杨绿竹,王婷,王蓉蓉,刘洁,等. 植物多酚氧化酶的生理功能、分离纯化及酶促褐变控制的研究进展[J]. 食品科学,2020,41(9):222−237. doi: 10.7506/spkx1002-6630-20190411-145 Wang XY,Yang LZ,Wang T,Wang RR,Liu J,et al. Recent progress toward understanding the physiological function,purification,and enzymatic browning control of plant polyphenol oxidases[J]. Food Science,2020,41 (9):222−237. doi: 10.7506/spkx1002-6630-20190411-145
[31] 田娇,刘园,房敏峰. 外源茉莉酸类激素对药用植物次生代谢的影响研究[J]. 天然产物研究与开发,2015,27(1):185−190. doi: 10.16333/j.1001-6880.2015.01.037 Tian J,Liu Y,Fang MF. Review on the influence of exogenous jasmonates on medicinal plant secondary metabolism[J]. Natural Product Research and Development,2015,27 (1):185−190. doi: 10.16333/j.1001-6880.2015.01.037
[32] 王金利,史胜青,贾利强,江泽平. 植物泛素结合酶E2功能研究进展[J]. 生物技术通报,2010(4):7−10. doi: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2010.04.002 Wang JL,Shi SQ,Jia LQ,Jiang ZP. Progress on functions of ubiquitin-conjugating enzyme (E2) in plants[J]. Biotechnology Bulletin,2010 (4):7−10. doi: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2010.04.002
[33] 李兴芬,苗雅慧,孙永江,张孟娟,张凌云. 青杄PwPEBP基因及其启动子序列的克隆与表达分析[J]. 北京林业大学学报,2019,41(4):8−20. Li XF,Miao YH,Sun YJ,Zhang MJ,Zhang LY. Cloning and expression analysis of PwPEBP gene and promoter sequence in Picea wilsonii[J]. Journal of Beijing Forestry University,2019,41 (4):8−20.
[34] 王寻,高凝,张富军,韩月彭,王小非,等. 苹果磷脂酰乙醇胺结合蛋白PEBP家族基因的鉴定与比较分析[J]. 植物生理学报,2021,57(10):1996−2010. doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2020.0395 Wang X,Gao N,Zhang FJ,Han YP,Wang XF,et al. Identification and comparative analysis of phosphatidyl ethanolamine binding protein (PEBP) family gene in apple[J]. Plant Physiology Journal,2021,57 (10):1996−2010. doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2020.0395
[35] 祝一文,车永梅,赵方贵,朱丹,刘新. 碱胁迫下H2S参与活性氧代谢和水稻幼苗生长的调控[J]. 农业生物技术学报,2018,26(7):1124−1131. Zhu YW,Che YM,Zhao FG,Zhu D,Liu X. H2S functions in growth regulation in rice (Oryza sativa) seedling and metabolism modulating of reactive oxygen under alkaline stress[J]. Journal of Agricultural Biotechnology,2018,26 (7):1124−1131.
[36] 张金梅,白雪,李玥莹,张颖. WRKY响应植物逆境的“角色”[J]. 安徽农业科学,2020,48(12):5−8. doi: 10.3969/j.issn.0517-6611.2020.12.002 Zhang JM,Bai X,Li YY,Zhang Y. WRKY’s “Role” in response to plant adversity[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences,2020,48 (12):5−8. doi: 10.3969/j.issn.0517-6611.2020.12.002
[37] 魏昕,刘雨恒,刘宇阳,殷晓浦,谢恬,等. 植物JAZ蛋白家族研究进展[J]. 植物生理学报,2021,57(5):1039−1046. doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2020.0532 Wei X,Liu YH,Liu YY,Yin XP,Xie T,et al. Advances of JAZ family in plants[J]. Plant Physiology Journal,2021,57 (5):1039−1046. doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2020.0532
[38] Chini A,Fonseca S,Fernández G,Adie B,Chico JM,et al. The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling[J]. Nature,2007,448 (7154):666−671. doi: 10.1038/nature06006
[39] Thines B,Katsir L,Melotto M,Niu YJ,Mandaokar A,et al. JAZ repressor proteins are targets of the SCFCOI1 complex during jasmonate signalling[J]. Nature,2007,448 (7154):661−665. doi: 10.1038/nature05960
[40] Chen XZ,Li JR,Liu YT,Wu DD,Huang HL,et al. PatSWC4,a methyl jasmonate-responsive MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)-related transcription factor,positively regulates patchoulol biosynthesis in Pogostemon cablin[J]. Ind Crops Prod,2020,154:112672. doi: 10.1016/j.indcrop.2020.112672
-
期刊类型引用(1)
1. 冷凇凝，谭延肖，张煜，吴玉森，韩双，陈晓乐. 楸子叶片酵母文库构建及甘油二酯激酶MpDGK7互作蛋白鉴定. 核农学报. 2024(09): 1691-1698 . 
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