Recent progress in medicinal plant transformation and genome editing
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摘要:
植物遗传转化和基因编辑技术是后基因组时代研究基因功能的重要手段。植物遗传转化从最初依赖组织培养的方式发展到了不依赖组织培养的直接转化方式；基因编辑技术从需要剪切特定基因片段再修复的第1阶段编辑技术，发展到了无需剪切即可在特定部位精确替换碱基或精确插入、删除片段以及大片段的第3阶段编辑技术，两种技术不断取得突破，推动着植物生物技术的飞速发展。本文综述了植物遗传转化方法与基因编辑技术的最新研究进展，以及它们在药用植物中的应用，并对药用植物遗传转化新方法和基因编辑技术的建立进行了展望，旨在为药用植物的基因功能和分子育种研究提供技术支撑。
Abstract:In the post-genomic era, both plant genetic transformation and genome editing have emerged as critical tools for gene function research. Plant genetic transformation has evolved from methods requiring tissue culture to new approaches that bypass tissue culture entirely. Furthermore, gene editing technology has advanced from initial techniques of targeted gene segment modification and repair to more sophisticated strategies, such as precise nucleotide substitution and targeted insertion, deletion, and segment editing at specific sites without the need for cutting. Recent advancements in both plant genetic transformation and genome editing have significantly accelerated the field of plant biotechnology. In the present paper, we review recent progress on plant genetic transformation and genome editing technologies, as well as their applications in medicinal plants, providing insights into gene function analysis and molecular breeding strategies for medicinal plants.
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Keywords:
- Medicinal plants /
- Genetic transformation /
- Gene editing
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药用植物是指含有生物活性成分，能够起到预防、治疗疾病和保健功能的植物。全球已知的植物约有27万种，其中，具有药用价值的超过1.3万种[1]。中国不仅是药用植物资源最丰富的国家之一，而且以植物药治病的历史悠久。
随着生物技术的快速发展，药用植物发挥药效的物质基础和遗传信息逐渐被阐明。以基因组为主的多组学数据逐步建立[2]，药用植物的研究进入后基因组时代。然而，目前相关研究仍面临着很多问题，如药用资源获取途径单一、药效成分含量过低、药效成分合成通路和作用机制未完全解析以及药用植物分子育种基础薄弱等。
植物遗传转化技术是指将目的基因（如品质相关基因、性状相关基因）通过某一方法（如农杆菌转化、基因枪轰击、病毒浸染、纳米颗粒浸染等）导入植物基因组中，使其在受体组织或植株中表达，最终达到植物品质改良、功能基因解析和分子育种的技术。基因编辑技术则是指利用基因编辑工具（CRISPR、ZFNs、TALENs等）对植物自身基因组进行精准编辑（插入或删除特定片段、碱基精准替换），最终实现植物品质改良、功能基因解析和精准分子育种的一门技术。植物遗传转化和基因编辑技术是后基因组时代基因功能和分子育种研究的重要手段，推动了植物生物技术的飞速发展。本文综述了植物遗传转化方法和基因编辑技术的最新研究进展，以及它们在药用植物中的应用，并对药用植物遗传转化新方法和基因编辑方法的建立进行了展望，旨在为药用植物的基因功能和分子育种研究提供支撑。
1. 植物遗传转化技术
遗传转化技术在药用植物品质改良、功能基因解析和分子育种研究中起重要作用。当前，植物遗传转化方法主要包括农杆菌、基因枪、纳米材料以及病毒载体介导的遗传转化（图1）。
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图 1 几种常见的遗传转化过程及农杆菌介导的遗传转化新方法A：农杆菌介导的遗传转化；B：基因枪介导的遗传转化；C：纳米材料介导的遗传转化；D：病毒介导的遗传转化；E：土壤中DRs引导的遗传转化；F：培养基中DRs引导的遗传转化；G：浸-切-芽系统遗传转化；H：发根农杆菌介导的遗传转化新方法。Figure 1. Traditional and novel methods of genetic transformation mediated by AgrobacteriumA: Agrobacterium-mediated transformation; B: Gene gun-mediated transformation; C: Nanoparticle-mediated transformation; D: Virus-mediated transformation; E: Transformation process guided by DRs in soil; F: Transformation process guided by DRs in culture medium; G: CDB system transformation; H: Transformation mediated by root-inducing Agrobacterium.1.1 农杆菌介导的遗传转化
该方法是利用农杆菌侵染植物时将T-DNA区导入植物基因组中进行的遗传转化[3]，常用的农杆菌包括根瘤农杆菌和发根农杆菌。农杆菌介导法常与组织培养技术相结合，通过农杆菌导入外源基因，再通过组织培养再生成植株（图1：A）。1988年，Valvekens等[4]将农杆菌介导的遗传转化与组织培养结合，建立了拟南芥（Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.）遗传转化方法，但该方法中植物的再生周期较长。2009年，Li等[5]建立了一种简易快速的瞬时转化表达方法——FAST，即利用农杆菌菌液和表面活性剂共同培养植物幼苗，比成株遗传转化更快，表面活性剂也能促进遗传转化，最终实现快速转化和表达目的基因。该方法周期短，在植物中被广泛应用。农杆菌菌株对植物遗传转化效率有很大影响，为了获得理想菌株，Aliu等[6]报道了一种农杆菌基因组编辑工具，通过INTEGRATE和Cre-loxP重组系统对农杆菌基因组进行编辑（片段插入与缺失），实现对农杆菌的精准改造，从而获得理想菌株，以提高遗传转化效率。2022年，Raman等 [7]在农杆菌中表达了来源于丁香假单胞菌的分泌系统T3SS编码基因，显著提高了农杆菌的瞬时侵染能力，并在拟南芥、烟草（Nicotiana tabacum L.）、小麦（Triticum aestivum L.）、紫花苜蓿（Medicago sativa L.）、柳枝稷（Panicum virgatum L.）等植物中得到了验证。
1.2 基因枪介导的遗传转化
基因枪介导的遗传转化方法是利用火药爆炸或高压气体的冲击力，将携带目的基因的微粒通过轰击导入植物细胞的遗传转化方法[8]（图1：B）。1985年，Morikawa等[9]成功将DNA通过显微注射导入原生质体，并再生为植株。20世纪80年代在大豆（Glycine max (L.) Merr.）[10]、玉米（Zea mays L.）[11]等植物细胞中利用基因枪法实现了遗传转化。Carsono等[12]通过Helios基因枪在水稻（Oryza sativa L.）愈伤组织中瞬时表达了GFP基因。Kuriakose等[13]利用基因枪在玫瑰（Rosa rugosa Thunb.）花叶和花瓣上表达了GFP基因。传统的粒子轰击需要轰击室（真空）和微粒加速装置，如今已开发出易于携带的手持式基因枪，使得轰击对象拓展到叶片、树皮甚至整个生物体。基因枪法降低了影响正常蛋白表达的风险，同时可通过改变轰击冲击力使基因枪法适用于其他植物组织或器官[14]。
1.3 纳米材料介导的遗传转化
纳米材料介导的遗传转化是通过透析法、静电接枝法等将核酸与纳米材料相结合，并递送至目标细胞基因组的遗传转化方法[15]。由于纳米粒子具有无需外力即可穿过植物细胞壁的特点[16]，将载有核酸的纳米材料直接打入叶片或与植物组织进行共培养，纳米载体和核酸即可进入植物细胞发挥作用（图1：C）。应用如下：Mitter等[17]使用层状双氢氧根粘土片装载dsRNA传递病毒特异性RNAi。Chang等[18]将介孔二氧化硅纳米颗粒与核酸连接，通过与拟南芥根共培养，实现了植物根的转化。Demirer等[15]利用碳纳米管材料（CNTs），稳定递送DNA且不整合至基因组。Wang等[19]报道了一种不依赖于组织培养和基因型的基因传递技术——氧化铁（Fe3O4）磁性纳米颗粒（MNPs）介导的花粉转染技术。Kandhol等[20]报道了利用细胞穿透肽（CPP）和细胞靶向肽（OTP）递送DNA、RNA至植物细胞的不同区室进行瞬时表达。
1.4 病毒载体介导的遗传转化
该方法是以病毒为载体，将目的基因组装于病毒上，并使重组病毒感染受体宿主细胞，完成遗传转化（图1：D）。病毒常作为载体携带外源基因和编辑系统元件，目前已被用于携带的编辑系统元件有小型巨核酸酶[21]、锌指核酸酶[22]、CRISPR/Cas组件[23]等。Ariga等[24]利用马铃薯病毒X（PVX）载体表达Cas9和gRNA，在烟草中实现了高效靶向诱导。Jin等[25]利用竹子花叶病毒（BaMV）载体系统成功表达了外源基因，以及过表达了内源基因。2023年，Liu等[26]建立了以番茄斑点枯萎病毒（TSWV）介导的传递CRISPR/Cas酶的遗传转化系统。
1.5 现代遗传转化新方法及思路
在植物遗传转化中，组织培养再生一般需要3~6个月，存在耗时长、遗传不稳定以及组织培养困难等问题。为解决这一问题，科学家们发现，发育调节因子DRs如Wus2 （Wuschel2）、Bbm（Baby Boom）等茎尖促分化因子可促进植物遗传转化体系的建立，利用DRs的遗传转化方法可以跨过组织培养，直接在叶片或茎中进行转化（图1：E、F）。2020年，Maher等[27]利用DRs的快速农杆菌共表达Fast TrACC（Fast-treated agrobacterium coculture）方法在烟草、番茄（Solanum lycopersicum L.）、土豆（Solanum tuberosum L.）中成功转化了外源基因。Cody等[28]总结了Fast TrACC方法。同一时期，Ge等[29]报道了一种茎尖分生组织细胞介导转化，实现了各种顽固性棉花（Gossypium spp.）基因型的快速有效转化。2022年，Cao等[30]使用切-浸-芽（CDB）递送系统在橡胶草（Taraxacum koksaghyz Rodin）、小冠花（Coronilla varia L.）、红薯（Ipomoea batatas L.）、臭椿（Ailanthus altissima Desf.）、辽东楤木（Aralia elata Miq.）、重瓣臭茉莉（Clerodendrum philippinum Schauer）中实现了遗传转化，该方法不受基因型限制、无需组织培养（图1：G）。此外，Meng等[31]构建了一种简单有效的根部转基因系统（图1：F）。
在遗传转化方法上，可根据不同方法的优缺点和研究目的进行选择（表1）。如在基因功能验证中，往往仅需要在特定部位（高产活性物质部位）进行瞬时表达，这时候可以选择基因枪、纳米材料介导的遗传转化方法。而在分子育种中，需要植株及后代能稳定地表达目的基因，此时可以选择农杆菌介导的遗传转化方法。当需要大量异源表达目的基因时，则可以选择病毒介导的遗传转化。近几年报道的遗传转化新方法能够有效地缩短转化周期，为药用植物遗传转化和基因编辑体系的建立提供了参考和新思路。
表 1 不同遗传转化方法的比较Table 1. Comparison of different genetic transformation methods介导方法
Method优势
Advantage劣势
Disadvantage农杆菌 易于转化大片段DNA、成本较低、
转化稳定耗时长、转染控制机制不清、物种特异性高 基因枪 易于操作、转化时间快、对转化的组织特异性不高 容易伤害细胞或组织、难以产生可遗传突变、成本高 纳米材料 能够保护核酸、污染较小、无需外力即可跨过细胞壁、免疫排斥反应低、毒副作用小 成本高、难以产生可遗传突变 病毒 转化率较高、可产生无转基因突变体，可传递大量编辑工具 物种特异性高、难以产生可遗传突变 目前遗传转化方法虽然较多，但也存在问题。在农杆菌介导的遗传转化方法中，由于不同植物对农杆菌的防御机制存在差异，其遗传转化效率也不同，同时也有失效的情况。因此，对不同植物进行农杆菌浸染时，需要探索浸染方法和材料，选择合适的农杆菌或改造农杆菌。
2. 植物基因编辑技术
基因编辑技术即定向对目标基因进行编辑，以获得理想突变体。目前基因编辑工具主要有3种，即锌指蛋白核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription activator-like (TAL) effector nucleases，TALENs）和簇状规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR/Cas）系统。基因编辑技术经历了3代发展历程。
第1代基因编辑工具——ZFNs，即以具有特异性识别功能的锌指蛋白作为靶向工具，以FokⅠ作为基因剪刀的靶向基因编辑工具，因此以二聚体形式发挥剪切作用，在使用时需要成对设计。但ZFNs技术存在专利封锁，ZFN组合技术、ZFN与FokⅠ连接技术、ZFN三维结构等技术都仅掌握在少数科学家手中，使得其至今无大规模应用，且没有突破性进展。第2代基因编辑工具——TALENs，即以具有特异性识别功能的TALEs蛋白作为靶向工具，以FokⅠ作为基因剪刀的靶向基因编辑工具，也以二聚体形式发挥作用，作为第一代编辑工具的替代品迅速发展。TALENs具有与第一代相同编辑效率的同时，其毒性更小，构建更容易，但尺寸较大，在大肠杆菌中的组装更为困难。第3代基因编辑工具——CRISPR/ Cas，是以Cas蛋白作为基因剪刀的基因编辑工具。与前两代相比，CRISPR系统更轻量级、设计更为简单、成本更低、相同靶点的编辑效率更高，因此在基因编辑中被广泛应用。该系统经历了3个发展阶段，第1阶段中，在进行基因编辑时会造成DNA双链断裂，修复断裂的方式有非同源重组和同源重组修复，这种断裂后再修复方式可能会出现产物混合体、易位、剪切过度等问题，具有不稳定性和不安全性，且靶向编辑后，编辑元件有可能保留在子代植株的基因组中。对于该现象，常用方法是将突变体子代异交，以筛选无转基因的突变后代；也可将CRISPR/Cas蛋白预先组装好后转染至受体，以产生无转基因的基因编辑突变体[32]。为了解决突变体子代基因组中仍存在基因编辑元件的问题，Yang等[33]开发了gRNA-TLS、Cas9-TLS传递系统，可快速获得非转基因突变体。第二阶段的CRISPR编辑系统避开了容易产生错误的断链后修复的过程，如Zhao等[34]开发的碱基编辑技术（Base editing，BE），能够在不引起双链断裂的情况下精准修饰转换单个碱基（C→T，T→C，A→G，G→A）；Anzalone等[35]开发了引导编辑技术（Prime editing，PE），能够在无需产生双链断裂的情况下实现基因片段的精准插入和缺失以及单碱基之间的转换，第2阶段的编辑方法推动了基因的精准编辑，但能够实现大片段DNA精准操纵的基因组编辑工具还十分有限。因此CRISPR系统发展至第3阶段，Sun等[36]开发了能够实现kb级大片段DNA甚至是染色体水平精准编辑的PrimeRoot系统，该系统将为基于基因堆叠的植物分子育种和合成生物学研究提供有力的技术支撑。
上述基因编辑新技术为药用植物基因修饰、功能验证提供了一定的技术支持。
3. 药用植物遗传转化方法与基因编辑技术
3.1 遗传转化技术在药用植物中的应用
遗传转化技术推动了药用植物基因功能和分子育种研究，其在药用植物中的应用情况[37-66]见表2。
表 2 遗传转化技术在药用植物中的应用Table 2. Application of genetic transformation technology in medicinal plants时间
Year药用植物
Medical plant拉丁名
Latin name外植体
Explant介导方法
Method参考文献
Reference2019 红豆杉 Taxus chinensis (Pilger) Rehd. 细胞悬液 农杆菌 [37] 2023 鹿茸草 Monochasma sheareri Maxim. ex Franch. et Savat. 幼苗外植体 农杆菌 [38] 2018 石斛 Dendrobium nobile Lindl. 原球茎 农杆菌 [39] 2016 青蒿 Herba Artemisiae Annuae 叶片 农杆菌 [40] 2015 虾子花 Woodfordia fruticose (L.) Kurz. 叶片 农杆菌 [41] 2016 紫果豌豆茄 Solanum trilobatum L. 幼芽叶 农杆菌 [42] 2010 南非醉茄 Withania somnifera (L.) Dunal 茎尖叶 农杆菌 [43] 2014 毛地黄 Digitalis purpurea L. 叶片 农杆菌 [44] 2013 三七 Panax notoginseng (Burkill) F. H. Chen ex C. H. Chow 子叶诱导的愈伤组织 农杆菌 [45] 2011 桔梗 Platycodon grandiflorus (Jacq.) A. DC. 幼苗子叶 农杆菌 [46] 2021 丹参 Salvia miltiorrhiza Bunge 叶片 农杆菌 [47] 2012 甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch. 细胞悬浮液 农杆菌 [48] 2012 半夏 Pinellia ternata (Thunb.) Ten. ex Breitenb. 试管苗 农杆菌 [49] 2022 菊花 Dendranthema morifolium (Ramat.) Tzvel. 幼苗下胚轴 农杆菌 [50] 2021 红腺忍冬 Lonicera hypoglauca Miq. 无菌苗叶片 农杆菌 [51] 2021 钩藤 Uncaria rhynchophylla(miq.)miq. ex havil. 茎、嫩叶、老叶 农杆菌 [52] 2020 杜仲 Eucommia ulmoides Oliv. 叶片愈伤组织 农杆菌 [53] 2020 黑果枸杞 Lycium ruthenicum Murr. 下胚轴 农杆菌 [54] 2016 芥蓝 Brassica alboglabra Bailey 子叶 农杆菌 [55] 2015 蛹虫草 Cordyceps militaris (L.ex Fr.) Link. 野生菌株 农杆菌 [56] 2013 冰草 Agropyron cristatum (L.) Gaertn 幼穗愈伤组织 农杆菌 [57] 2010 铁皮石斛 Dendrobium candidum Wall. ex Lindl. 原球茎 基因枪 [58] 2010 苎麻 Boehmeria nivea (L.) Gaud 子叶愈伤组织 基因枪 [59] 2008 白术 Atractylodes macrocephala Koidz. 茎尖 基因枪 [60] 2007 枸杞 Lycium chinense Miller 叶片 基因枪 [61] 2019 芝麻菜 Eruca vesicaria subsp. sativa (Miller) Thellung 叶片 纳米材料 [62] 2023 麻竹 Dendrocalamus latiflorus Munro 叶片 纳米材料 [25] 2021 丝瓜 Luffa cylindrica (L.) Roem 叶片 病毒载体 [65] 2006 大豆 Glycine max (L.) Merr. 叶片 病毒载体 [66] 药用植物中，利用农杆菌介导的遗传转化方法的报道较多。廖卫芳等[37]在红豆杉（Taxus chinensis (Pilger) Rehd.）细胞悬浮系中过表达了TcCYP725A22基因。Bai等[38]建立了鹿茸草（Monochasma sheareri Maxim. ex Franch. et Savat.）毛状根再生体系。Utami等[39]以原球茎为外植体，建立了石斛（Dendrobium nobile Lindl.）的遗传转化体系。Dilshad等[40]在青蒿（Herba Artemisiae Annuae）叶片和带节段中转化了GUS基因和hpt基因。Bulle等[41]以虾子花（Woodfordia fruticose (L.) Kurz.）叶片切段为外植体也转化了这两个基因。Shilpha等[42]在紫果豌豆茄（Solanum trilobatum L.）的幼芽叶、Pandey等[43]在南非醉茄（Withania somnifera (L.) Dunal）茎尖叶中转化了GUS基因和hpt基因。Li等[44]以毛地黄（Digitalis purpurea L.）的成熟叶片为外植体转化了GUS基因和npt基因。孙颖等[45]以三七（Panax notoginseng (Burkill) F. H. Chen ex C. H. Chow）子叶诱导的愈伤组织为外植体过表达了SS基因。Park等[46]以桔梗（Platycodon grandiflorus (Jacq.) A. DC.）12日幼苗子叶作为外植体，建立了遗传转化方法。Zhou等[47]将丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）叶片作为外植体，获得了转化毛状根。Li等[48]针对甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）悬浮细胞建立了遗传转化方法。郭朝阳等[49]以半夏（Pinellia ternata (Thunb.) Ten. ex Breitenb.）试管苗为外植体，建立了高效遗传转化体系。Gupta等[50]在菊花（Dendranthema morifolium (Ramat.) Tzvel.）中过表达了二磷酸合成酶基因（CDS），提高了拟除虫菊酯的产量。谭木秀等[51]以红腺忍冬（Lonicera hypoglauca Miq.）无菌种苗叶片作为外植体，优化了其遗传转化体系。姜育松等[52]建立了勾藤（Uncaria rhynchophylla (miq.) miq. ex havil.）发根的高效诱导体系。刘闵豪等[53]优化了杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）叶片愈伤组织农杆菌遗传转化方法。王静等[54]以黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）下胚轴作为外植体，建立了遗传转化体系。在农杆菌介导的遗传转化中，乔木类植物的遗传转化结果大多数是构建转基因细胞，草本及灌木类药用植物的转化结果大多为外植体或由外植体诱导而成的整株。通常选择分化程度不高且分裂能力较强的部位（嫩叶、幼芽叶、胚胎、原球茎等）作为外植体，采用浸染的方式进行转化。
基因枪介导的遗传转化在药用植物中也有报道。陈长明等[55]利用基因枪将Bt抗虫基因Cry2Aa2转化到芥蓝（Brassica alboglabra Bailey）中，获得了抗虫转基因植株。茅文俊等[56]利用基因枪将草铵膦抗性基因Bar和绿色荧光蛋白基因转入蛹虫草（Cordyceps militaris (L.ex Fr.) Link.），建立了基因枪介导的蛹虫草转化体系。徐春波等[57]利用基因枪将拟南芥外源脱水应答转录因子CBF4基因成功转化入冰草（Agropyron cristatum (L.) Gaertn）中，获得了抗性植株。杨雪飞等[58]利用基因枪将抗旱耐盐基因lea3转化入铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura & Migo），获得了耐盐性强的转基因石斛。宫本贺等[59]利用基因枪将外源双价抗虫基因转化入苎麻（Boehmeria nivea (L.) Gaud）中，获得了抗虫植株。毛碧增等[60]利用基因枪法在白术（Atractylodes macrocephala Koidz.）中转化了水稻几丁质酶基因（RCH10）和苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因（AGLU），获得了抗立枯病的转基因植株。顾海燕等[61]利用基因枪法将抗肝炎疫苗基因 （HisE）转入枸杞（Lycium chinense Miller）中，培育出一种具有特殊用途的枸杞品种。
纳米材料介导的遗传转化在药用植物中的应用报道较少，Demirer等[62]利用高纵横比碳纳米管（CNT）纳米颗粒（NP）将质粒DNA有效递送到芝麻菜（Eruca vesicaria subsp. sativa (Miller) Thellung）中，实现了高蛋白表达。以纳米材料介导的遗传转化中，利用磁性纳米颗粒携带目的基因转染花粉的应用较多，但目前多用于农作物（棉花[63]、玉米[19]），在药用植物中的应用有待推进。此外，纳米材料在介导叶绿体转化方面也值得尝试，如Kwak等[64]报道了利用单壁碳纳米管选择性地将质粒DNA递送至叶绿体，该工具可在作物中实现稳定的转化，有助于作物改良。
最近，病毒介导的遗传转化方法也被应用于药用植物中。Jin等[25]利用病毒载体系统在麻竹（Dendrocalamus latiflorus Munro）中表达了外源基因（EGFP/RUBY），并过表达了竹子内源基因ACE1和DEC1。Fang等[65]利用烟草环斑病毒（TRSV），在丝瓜（Luffa cylindrica (L.) Roem）叶片中表达了GFP基因，建立了病毒介导的遗传转化方法。Zhang等[66]利用豆荚斑驳病毒（BPMV）载体在大豆（Glycine max (L.) Merr.）中稳定表达了GFP和磷蛋白乙酰转移酶基因，建立了病毒介导的大豆遗传转化方法。
在药用植物中，虽然有许多物种建立了遗传转化方法，但在实际应用中仍存在转化材料不易获得、转化周期过长、操作困难等问题。特别是缺乏通用遗传转化方法，致使每种药用植物都需要先建立遗传转化平台，耗时耗力。前述新的遗传转化方法值得在药用植物中尝试，以建立一种快速、有效的通用遗传转化方法，对于基因研究、分子育种和绿色生物制造具有重要作用。
3.2 基因编辑技术在药用植物中的应用
与遗传转化不同的是，基因编辑技术能够精准地在特定基因位点引起点突变、片段的插入与缺失，安全性和稳定性更高，能够更直接地研究药用植物基因功能和分子育种。
由于比ZFNs、TALENs系统操作简单、价格较低、效率更高，CRISPR系统常被应用于药用植物的基因编辑中[67-80]。目前主要应用CRISPR/Cas9编辑系统，龙雨青等[68]对其进行了综述，在此基础上，我们进一步做了补充（表3）。
表 3 基因编辑技术在药用植物中的应用Table 3. Application of genetic editing technology in medicinal plants时间
Year药用植物
Medical plant拉丁名
Latin name外植体
Explant靶向基因
Targeted gene参考文献
Reference2017/2021 丹参 Salvia miltiorrhiza Bunge 叶片 SmCPS1/ CYP76AK2/
CYP76AK3[69]
[70]2021 颠茄 Atropa belladonna L. 子叶 AbH6H [71] 2021 茶树 Camellia sinensis (L.) O. Ktze. 愈伤组织 CsHB1 [72] 2021 聚合草 Symphytum officinale L. 幼叶片 HSS [73] 2016 铁皮石斛 Dendrobium officinale Kimura & Migo 原球茎 C3H/C4H/4CL/
CCR和IRX[74] 2018 薯蓣 Dioscorea polystachya Turczaninow 茎愈伤组织 Dzfps [75] 2022 苦荞麦 Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn. 幼苗子叶 FtMYB45 [76] 2021 大麻 Cannabis sativa L. 下胚轴 CsPDS [77] 2017 灵芝 Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst. 原生质体 uar3 [78] 2022 茯苓 Poria cocos (Schw.) Wolf 原生质体 uar3 [79] 2016 罂粟 Papaver somniferum L. 种子 4'OMT2 [80] 在CRISPR系统第1阶段编辑工具中，Li等[69]利用CRISPR/Cas9精确敲除了参与丹参酮生物合成的二萜合酶基因（SmCPS1）。Li等[70]利用CRISPR/Cas9精准诱变了参与丹参酮合成的CYP76AK2和CYP76AK3基因。Zeng等[71]利用 CRISPR敲除了药用植物颠茄（Atropa belladonna L.）的AbH6H基因，产生了不含山莨菪碱和东莨菪碱的植株。Ma等[72]利用 CRISPR敲除了茶（Camellia sinensis (L.) O. Ktze.）中的CsHB1基因，减少了咖啡因的累积。Zakaria等[73]使用CRISPR敲除了聚合草（Symphytum officinale L.）毛状根中调控PAs合成的基因（HSS），阻碍了有毒物质吡咯烷啶生物碱（PA）的合成。Kui等[74]在铁皮石斛中使用CRISPR敲除了木质纤维素合成通路上的基因。Feng等[75]使用CRISPR技术靶向突变了薯蓣（Dioscorea polystachya Turczaninow）Dzfps基因，产生了角鲨烯含量显著降低的突变体。Wen等[76]利用CRISPR技术敲除了苦荞麦（Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn.）FtMYB45基因，使得毛状根突变体中黄酮类化合物的含量增加。Zhang等[77]利用CRISPR/Cas9工具编辑了药用植物大麻（Cannabis sativa L.）的PDS基因，生成了具有白化表型的幼苗。Qin等[78]利用CRISPR系统成功编辑了灵芝（Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst.）的ura3基因，获得了抗5-FOA的突变体。Xie等[79]利用CRISPR系统成功编辑了茯苓（Poria cocos (Schw.) Wolf）的ura3基因，获得了抗5-FOA的突变体。Alagoz等[80]在罂粟（Papaver somniferum L.）中应用CRISPR编辑了4'OMT2基因，产生了苄基异喹啉生物碱（BIAs）合成减少的突变体。
在CRISPR系统第2阶段编辑工具中，PE编辑体系在农作物中应用较多，但在药用植物中的报道较少。Qiao等[81]利用优化后的PE编辑系统在玉米中实现了同时对多基因多靶点的可遗传精准编辑，获得了除草剂抗性突变株。Lin等[82]利用PE编辑系统在水稻中将蓝色荧光蛋白转化为绿色荧光蛋白，优化了PE编辑方法。
在CRISPR系统第3阶段编辑工具中，由于PrimeRoot系统出现时间不长，目前仅在水稻中有应用。Sun等[36]利用该系统将长达11.1 kb的DNA精确插入植物基因组，将一个包含PigmR的基因盒精准整合到水稻基因组位点，获得了抗稻瘟病基因编辑植株。
目前，基因编辑工具在农作物中被优化和应用较多，而药用植物基因编辑还多停留在精准敲除植物自身基因阶段，精确插入和改造碱基较少。第2、3阶段基因编辑技术能够实现基因精确的插入和敲除、碱基修改和插入大片段基因，但这些技术在药用植物中应用较少或尚未被开发。
4. 展望
遗传转化和基因编辑技术为植物基因功能和分子育种研究提供了重要支撑。虽然许多药用植物已建立遗传转化方法，但多存在耗时长、转化率低、材料不易获取等缺点，最新的转化方法在药用植物中尚未得到广泛应用。基因编辑技术在药用植物中的应用也处于滞后阶段，多用于靶向片段的敲除，而精准的碱基编辑、片段的插入和敲除（BE、PE）以及能实现大片段DNA甚至是染色体水平的精准编辑的PrimeRoot技术在药用植物中并未得到充分应用。为了提高活性成分产量，增加植物适应性，解析药效成分合成通路与作用机制，以及开展分子育种，对药用植物功能基因组的研究展望如下：
（1）推进遗传转化新方法的应用。药用植物种类多，科属广，所含代谢成分丰富多样，导致了目前缺乏高效、快速的通用型遗传转化方法。在模式植物和农作物上已开发的新方法转化效率高，用时短，外植体依赖性低，无需组织培养甚至无菌操作，可尝试用于药用植物的遗传转化。
（2）加强外植体选择的探索。在遗传转化外植体选择中，通常选择分化程度低或易于吸收外源物（核酸）的组织，如愈伤组织、原生质体、种子等。近年来发现，植物干细胞也具有以上特性，可能具有用于遗传转化和转基因的潜能，这些外植体在药用植物中也可尝试应用。
（3）优化基因编辑技术。目前CRISPR编辑技术不断得到突破，其准确性与稳定性不断提高，加强这些新技术在药用植物中的应用，有望推动药用植物的基因功能验证与分子育种。
（4）加强药用植物分子育种研究。农作物育种已发展至智慧育种时代。而大多数药用植物仍处于杂交育种时代，仅有丹参、人参等少数药用植物采用基因编辑技术发展至智慧育种时代。将基因编辑技术应用于药用植物分子育种的空缺较大，相关研究有待进一步推进。
（5）药用植物遗传转化和基因编辑技术的难点与挑战。基因编辑体系建立的前提是具有稳定的遗传转化体系，而针对每种植物建立独特的遗传转化方法耗时耗力。建立一种通用的高效遗传转化方法对药用植物遗传转化和基因编辑研究具有重要意义。
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图 1 几种常见的遗传转化过程及农杆菌介导的遗传转化新方法
A：农杆菌介导的遗传转化；B：基因枪介导的遗传转化；C：纳米材料介导的遗传转化；D：病毒介导的遗传转化；E：土壤中DRs引导的遗传转化；F：培养基中DRs引导的遗传转化；G：浸-切-芽系统遗传转化；H：发根农杆菌介导的遗传转化新方法。
Figure 1. Traditional and novel methods of genetic transformation mediated by Agrobacterium
A: Agrobacterium-mediated transformation; B: Gene gun-mediated transformation; C: Nanoparticle-mediated transformation; D: Virus-mediated transformation; E: Transformation process guided by DRs in soil; F: Transformation process guided by DRs in culture medium; G: CDB system transformation; H: Transformation mediated by root-inducing Agrobacterium.
表 1 不同遗传转化方法的比较
Table 1 Comparison of different genetic transformation methods
介导方法
Method优势
Advantage劣势
Disadvantage农杆菌 易于转化大片段DNA、成本较低、
转化稳定耗时长、转染控制机制不清、物种特异性高 基因枪 易于操作、转化时间快、对转化的组织特异性不高 容易伤害细胞或组织、难以产生可遗传突变、成本高 纳米材料 能够保护核酸、污染较小、无需外力即可跨过细胞壁、免疫排斥反应低、毒副作用小 成本高、难以产生可遗传突变 病毒 转化率较高、可产生无转基因突变体，可传递大量编辑工具 物种特异性高、难以产生可遗传突变 
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表 2 遗传转化技术在药用植物中的应用
Table 2 Application of genetic transformation technology in medicinal plants
时间
Year药用植物
Medical plant拉丁名
Latin name外植体
Explant介导方法
Method参考文献
Reference2019 红豆杉 Taxus chinensis (Pilger) Rehd. 细胞悬液 农杆菌 [37] 2023 鹿茸草 Monochasma sheareri Maxim. ex Franch. et Savat. 幼苗外植体 农杆菌 [38] 2018 石斛 Dendrobium nobile Lindl. 原球茎 农杆菌 [39] 2016 青蒿 Herba Artemisiae Annuae 叶片 农杆菌 [40] 2015 虾子花 Woodfordia fruticose (L.) Kurz. 叶片 农杆菌 [41] 2016 紫果豌豆茄 Solanum trilobatum L. 幼芽叶 农杆菌 [42] 2010 南非醉茄 Withania somnifera (L.) Dunal 茎尖叶 农杆菌 [43] 2014 毛地黄 Digitalis purpurea L. 叶片 农杆菌 [44] 2013 三七 Panax notoginseng (Burkill) F. H. Chen ex C. H. Chow 子叶诱导的愈伤组织 农杆菌 [45] 2011 桔梗 Platycodon grandiflorus (Jacq.) A. DC. 幼苗子叶 农杆菌 [46] 2021 丹参 Salvia miltiorrhiza Bunge 叶片 农杆菌 [47] 2012 甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch. 细胞悬浮液 农杆菌 [48] 2012 半夏 Pinellia ternata (Thunb.) Ten. ex Breitenb. 试管苗 农杆菌 [49] 2022 菊花 Dendranthema morifolium (Ramat.) Tzvel. 幼苗下胚轴 农杆菌 [50] 2021 红腺忍冬 Lonicera hypoglauca Miq. 无菌苗叶片 农杆菌 [51] 2021 钩藤 Uncaria rhynchophylla(miq.)miq. ex havil. 茎、嫩叶、老叶 农杆菌 [52] 2020 杜仲 Eucommia ulmoides Oliv. 叶片愈伤组织 农杆菌 [53] 2020 黑果枸杞 Lycium ruthenicum Murr. 下胚轴 农杆菌 [54] 2016 芥蓝 Brassica alboglabra Bailey 子叶 农杆菌 [55] 2015 蛹虫草 Cordyceps militaris (L.ex Fr.) Link. 野生菌株 农杆菌 [56] 2013 冰草 Agropyron cristatum (L.) Gaertn 幼穗愈伤组织 农杆菌 [57] 2010 铁皮石斛 Dendrobium candidum Wall. ex Lindl. 原球茎 基因枪 [58] 2010 苎麻 Boehmeria nivea (L.) Gaud 子叶愈伤组织 基因枪 [59] 2008 白术 Atractylodes macrocephala Koidz. 茎尖 基因枪 [60] 2007 枸杞 Lycium chinense Miller 叶片 基因枪 [61] 2019 芝麻菜 Eruca vesicaria subsp. sativa (Miller) Thellung 叶片 纳米材料 [62] 2023 麻竹 Dendrocalamus latiflorus Munro 叶片 纳米材料 [25] 2021 丝瓜 Luffa cylindrica (L.) Roem 叶片 病毒载体 [65] 2006 大豆 Glycine max (L.) Merr. 叶片 病毒载体 [66]
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表 3 基因编辑技术在药用植物中的应用
Table 3 Application of genetic editing technology in medicinal plants
时间
Year药用植物
Medical plant拉丁名
Latin name外植体
Explant靶向基因
Targeted gene参考文献
Reference2017/2021 丹参 Salvia miltiorrhiza Bunge 叶片 SmCPS1/ CYP76AK2/
CYP76AK3[69]
[70]2021 颠茄 Atropa belladonna L. 子叶 AbH6H [71] 2021 茶树 Camellia sinensis (L.) O. Ktze. 愈伤组织 CsHB1 [72] 2021 聚合草 Symphytum officinale L. 幼叶片 HSS [73] 2016 铁皮石斛 Dendrobium officinale Kimura & Migo 原球茎 C3H/C4H/4CL/
CCR和IRX[74] 2018 薯蓣 Dioscorea polystachya Turczaninow 茎愈伤组织 Dzfps [75] 2022 苦荞麦 Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn. 幼苗子叶 FtMYB45 [76] 2021 大麻 Cannabis sativa L. 下胚轴 CsPDS [77] 2017 灵芝 Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst. 原生质体 uar3 [78] 2022 茯苓 Poria cocos (Schw.) Wolf 原生质体 uar3 [79] 2016 罂粟 Papaver somniferum L. 种子 4'OMT2 [80]
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