Effect of sex and leaf shape on gas exchange parameters and chlorophyll fluorescence characteristics in Sabina chinensis (L.) Ant
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摘要:
为分析性别及叶形对光合能力、能量分配与耗散的影响，本研究以圆柏（Sabina chinensis （L.） Ant.）雌株、雄株和雌雄同株3种个体的鳞叶和刺叶为材料，测定了气体交换参数、叶绿素荧光特性参数和非结构性碳水化合物（NSC）的含量。结果显示：雌株和雄株刺叶的净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）、水分利用率（WUE）和NSC显著高于鳞叶；雄株、雌株刺叶的非光化光淬灭系数（NPQ）和光能捕获能力（1/Fo−1/Fm）显著高于鳞叶，最大光化学量子效率（Fv/Fm）、实际电子传递速率（ETR）、实际光化学量子效率（ФPSⅡ）、光化光淬灭系数（qP）、潜在最大电子传递速率（rETRmax）和半饱和光强（Ik）显著低于鳞叶。雌株的Pn、NSC、NPQ和1/Fo−1/Fm显著高于雄株， Fv/Fm、ETR、qP、rETRmax和Ik显著低于雄株。相关性分析表明，NSC与Pn和1/Fo−1/Fm呈极显著正相关，与ETR呈显著负相关。研究结果表明，圆柏刺叶通过提高光能捕获能力及热散耗能力适应强光照环境，而鳞叶通过提高光能利用效率和光保护机制，能够适应弱光照环境。雌株可通过较强的光合速率获取较多的NSC，从而满足其生长繁殖的需求。
Abstract:This study investigated the effects of sex and leaf morphology on photosynthetic capacity, energy allocation, and dissipation in Sabina chinensis (L.) Ant. The experimental materials included prickly and scaly leaves from female, male, and monoecious plants. Gas exchange parameters, chlorophyll fluorescence characteristics, and non-structural carbohydrate (NSC) content were measured. Results showed that prickly leaves from both female and male plants exhibited significantly higher photosynthetic rate (Pn), the transpiration rate (Tr), the stomatal conductance (Gs), water use efficiency (WUE), and NSC compared to scaly leaves. Similarly, the non-photochemical quench (NPQ) and the ability of PSⅡ reaction center to trap energy from antenna pigment (1/Fo−1/Fm) were significantly higher in male and female prickly leaves, while maximum photochemical efficiency (Fv/Fm), the electron transfer rate (ETR), actual photochemical quantum efficiency (ФPSⅡ), photochemical quenching (qP), the highest maximum relative electron transfer rate (rETRmax), and half-saturated light intensity (Ik) were significantly lower in male and female prickly leaves compared to scaly leaves. Among sexes, female plants demonstrated significantly higher Pn, NSC, NPQ, and 1/Fo−1/Fm than male plants, while Fv/Fm, ETR, qP, rETRmax, and Ik were significantly lower in females. Correlation analysis showed a strong positive correlation between NSC and both Pn and 1/Fo−1/Fm, but a strong negative correlation between NSC and ETR. In conclusion, prickly leaves adapt to high-light environments by improving light energy capture ability and heat dissipation ability, whereas scaly leaves adapt to low-light environments by improving light energy utilization efficiency and light protection mechanisms. The coexistence of prickly and scaly leaves allows S. chinensis to meet the demands for photosynthate production and adapt to varying light conditions during growth and development. Female plants, through higher Pn, achieve greater NSC content, supporting the requirements for reproduction and growth.
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滇南青冈（Quercus austroglauca Y. T. Chang）为壳斗科栎属常绿乔木，是组成常绿阔叶林的主要树种之一；分布于云南东南部，生长于海拔850 ~ 1500 m的山地森林中。其木材材质重且硬，强度高，收缩性大，耐腐力强，可作桩柱、工具柄、枕木等用材；树皮与壳斗富含单宁，可提制栲胶；种子富含淀粉，可供作酿酒、饲料等原料[1]。目前，滇南青冈的分类地位还存在争议。前人研究发现黄枝青冈（Cyclobalanopsis fulvisericeus Y. C. Hsu et D. M. Wang）、环青冈（C. annulata Sm.）与滇南青冈在稳定的形态特征方面（果型、叶形）基本相同，且聚类分析时能聚成一个单元，其差异主要体现在一些不稳定的性状上，如在毛被分化上，滇南青冈叶背与果实表现出无毛或单毛两种形态，因此建议将黄枝青冈和环青冈进行归并，作为滇南青冈的亚种处理[2]。邓敏[3]依据从龙迈青冈（Q. lungmaiensis (Hu) C. C. Huang et Y. T. Chang）模式标本地采集的龙迈青冈标本坚果近球形，与滇南青冈的果实形态一致，建议将二种归并。由此可见，滇南青冈在属内的系统位置还不明确，种间关系尚不清晰。
与核基因组相比，叶绿体基因组具有低分子量、结构简单、单拷贝、基因含量和基因序列高度保守、低基因置换等特征[4]。被子植物的叶绿体基因组长度在120 ~ 170 kb [5]。大多数叶绿体基因组由1个小单拷贝（Small single copy，SSC）区域，两个反向重复（Inverted repeats，IRa和IRb）区域、1个大单拷贝（Large single copy，LSC）区域这种典型的4部分结构组成[6]。随着高通量测序技术的发展，测序成本迅速下降[7]，可以较为容易地获得完整的叶绿体基因组，为研究植物物种的遗传变异与基因组学提供了便利。
密码子是传递生物遗传信息的序列单位[8]。每种氨基酸最少对应着一个密码子，编码同种氨基酸的不同密码子，称为同义密码子[9]。蛋白质合成时，同义密码子的使用率并不相同[10]。这种偏好使用一种或几种特定同义密码子的现象即密码子偏好性[11]。本研究通过测序得到了滇南青冈的完整叶绿体基因组序列，分析了基因组基本结构、密码子偏好性及其影响因素，研究结果旨在为分析该物种异源基因表达效率以及遗传信息传递规律提供参考，并对栎属系统发育研究以及该物种的品种改良、遗传育种等奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 实验材料采集与测序
滇南青冈采集于云南省昆明植物园（25°07′32.48″N，102°44′22.32″E，海拔1950 m）。凭证标本（凭证号：HZ210919）存放于西华师范大学标本馆。收集到的新鲜叶子立即用硅胶干燥，并及时储存在−80℃冰箱中，之后送至南京奥维森基因科技有限公司，利用Illumina Hiseq二代高通量测序技术进行测序。
1.2 装配、注释及基因组图谱绘制
本研究利用FASTQC（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）软件对测序数据进行质控，并将质控后的数据用GetOrganelle 1.7.5.3软件[12]进行组装，再将原始数据map到组装好的序列上查看覆盖率，利用Gapcloser软件[13]补齐组装过程中出现的空缺。然后，以从NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）网站上下载的栎属细叶青冈（Q. shennongii C. C. Huang et S. H. Fu）为参考序列（GenBank登录号为MN199024），利用在线软件GPGAVAS2（http://www.herbalgenomics.org/cpgavas/）进行注释。最后，在Geneious 9.0.2软件[14]中，进行手动修改与调整，得到最终的注释文件，再利用在线工具OGDRAW （https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGD raw.html）完成基因组图谱的绘制。将注释的完整叶绿体基因组序列提交至GenBank（登录号为 ON258630）。
1.3 密码子偏好性及其影响因素分析
首先，用Geneious 9.0.2软件提取滇南青冈的蛋白编码序列（Coding sequence，CDS），为减少样本误差，删除小于300 bp和重复的CDS，最终保留52条起始密码子为ATG的CDS[15]。然后，利用EMBOSS软件（https://www.bioinformatics.nl/emboss-explorer/），计算密码子各碱基的GC含量（第1 ~ 3位的GC含量依次以GC1、GC2和GC3表示）以及总GC平均含量（GCall）。最后，利用CodonW 1.4.2软件（https://sourceforge.net/projects/codonw/）分析相对同义密码子使用度（Relative synonymous codon usage，RSCU）、有效密码子数（Effective number of codon，ENC）等参数，使用IBM SPSS Statistics 26（https://www.ibm.com/products/spss-statistics）进行相关性分析。
为明确滇南青冈密码子偏好性的影响因素，从以下3个方面进行分析。首先，以GC3为横坐标、GC12（第1位和第2位密码子GC含量的平均值）为纵坐标，利用Origin 2021（https://www.originlab.com/origin）软件进行中性绘图，根据散点图回归曲线的相关系数以及GC3与GC12的相关性分析，判断影响其密码子使用偏好性的主要因素。若相关性显著，则其密码子偏好性主要受突变影响，反之受选择影响更大。其次，进行ENC-plot绘图时，一般认为分布于曲线附近的基因密码子偏好性主要受突变影响，反之则受选择影响[9, 16]。为了更好地评估影响密码子偏好性的因素，本研究还对ENC比值（ENC ratio）进行了计算，横坐标与中性绘图相同，纵坐标为ENC的值。标准曲线计算公式为ENC = GC3 + 2 + 29 / [GC32 + (1 − GC3)2]，ENC ratio = (ENC期望 − ENC实际) / ENC期望 [17]。最后，利用PR2-plot分析各密码子第3位碱基G、C和A、T之间突变是否平衡。以G3 / (C3 + G3)为横坐标，A3 / (T3 + A3)为纵坐标进行分析，图的中心点表示G = C、A = T，此时其密码子偏好性完全受突变的影响，由中心点到图中各点发出的矢量分别代表了各个基因的偏性方向以及程度[18]。
最优密码子的确定方法是，在ENC值最小和最大的两端各选5个基因，分别建成低表达库、高表达库，再计算两库的RSCU值和ΔRSCU，两库RSCU > 1且ΔRSCU > 0.08的密码子为最优密码子[19]。
1.4 叶绿体基因组比较分析及系统发育分析
从NCBI上下载青冈（Q. glauca Thunb.，NC_036930.1）、多脉青冈（Q. hypargyrea (Seemen) C. C. Huang et Y. T. Chang，MW450871.1）、小叶青冈（Q. myrsinifolia Blume，MN199025.1）和褐叶青冈（Q. stewardiana A. Camus，MN199023.1）的叶绿体基因组，利用mVISTA（https://genome.lbl.gov/vista/mvista/instructions.shtml）将其与滇南青冈叶绿体基因组进行多重对比，使用IRscope（https://irscope.shinyapps.io/irapp/）分析它们与滇南青冈叶绿体基因组的IR边界收缩与扩张情况。
将滇南青冈与从NCBI上下载的12种壳斗科植物的叶绿体基因组进行系统发育分析，以其中的台湾水青冈（Fagus hayatae Palib.）与水青冈（F. longipetiolata Seem.）作为外类群。运用 MAFFT软件[20]对叶绿体基因组序列进行比对，利用MEGA 7软件[21]将比对好的序列开头和结尾未对齐部分进行修剪，并分析出最优模型（GTR + G + I），设置自展值为1000，构建ML（Maximum likelihood）系统发育树。另将修剪好的序列用MEGA 7软件以Kimura 2-parameter为模型，自展值设为1000，构建NJ（Neighbor-joining）系统发育树。
2. 结果与分析
2.1 滇南青冈叶绿体基因组结构特征
本研究组装的滇南青冈叶绿体基因组呈双链环状结构，由典型的4部分结构组成，即LSC、IRa、IRb、SSC，其长度分别为90 369、25 846、25 846、18 852 bp，GC含量分别为34.77%、42.77%、42.77%、31.33%（表1）。滇南青冈叶绿体基因组大小为160 913 bp，共133个基因，包括88个编码蛋白质的基因，8个rRNA基因和37个tRNA基因（图1）。133个基因依照其功能可划分为4类，其中光合作用相关基因46个，自我复制相关基因75个，其他基因4个，未知功能基因8个（表2）。
表 1 滇南青冈叶绿体基因组4个区域的GC含量及序列长度Table 1. GC content and sequence length of four regions of Quercus austroglauca chloroplast genome区域
RegionA / % T / % C / % G / % GC / % 长度
Length / bpLSC 31.91 33.32 17.76 17.01 34.77 90 369 IRa 28.67 28.57 20.61 22.16 42.77 25 846 IRb 28.67 28.57 20.61 22.16 42.77 25 846 SSC 34.34 34.55 16.39 14.73 31.33 18 852 ![]()
图 1 滇南青冈叶绿体基因组图谱圈外基因逆时针转录，圈内基因顺时针转录，内圈的深灰色表示GC含量，浅灰色表示AT含量。Figure 1. Gene map of Quercus austroglauca chloroplast genomeGenes outside circle are transcribed counterclockwise and genes inside circle are transcribed clockwise. Dark gray of inner circle indicates GC content, while light gray indicates AT content.表 2 滇南青冈叶绿体基因组的基因组成情况Table 2. Gene composition of Quercus austroglauca chloroplast genome基因功能
Gene function基因分组
Gene group基因名称
Gene name光合作用 光系统Ⅰ psaA、psaB、psaC、psaI、psaJ 光系统Ⅱ psbA、psbB、psbC、psbD、psbE、psbF、psbH、psbI、psbJ、
psbK、psbL、psbM、psbN、psbT、psbZ细胞色b/f复合物 petA、petB*、petD*、petG、petL、petN ATP合成酶 atpA、atpB、atpE、atpF*、atpH、atpI NADH脱氢酶 ndhA*、ndhB(2)*、ndhC、ndhD、ndhE、ndhF、ndhG、
ndhH、ndhI、ndhJ、ndhK核酮糖二磷酸羧化酶大亚基 rbcL 蛋白酶 clpP** 自我复制 RNA聚合酶 rpoA、rpoB、rpoC1*、rpoC2 核糖体蛋白小亚基 rps2、rps3、rps4、rps7(2)、rps8、rps11、rps12(2)**、
rps14、rps15、rps16*、rps18、rps19核糖体蛋白大亚基 rpl2(2)*、rpl14、rpl16*、rpl20、rpl22、rpl23(2)、rpl32、rpl33、rpl36 转运RNA trnA-UGC(2)*、trnC-GCA、trnD-GUC、trnE-UUC、trnF-GAA、trnfM-CAU、trnG-GCC*、
trnG-UCC、trnH-GUG、trnI-CAU(2)、trnI-GAU(2)*、trnK-UUU*、trnL-CAA(2)、
trnL-UAA*、trnL-UAG、trnM-CAU、trnN-GUU(2)、trnP-UGG、trnQ-UUG、
trnR-ACG(2)、trnR-UCU、trnS-GCU、trnS-GGA、trnS-UGA、trnT-GGU、
trnT-UGU、trnV-GAC(2)、trnV-UAC*、trnW-CCA、trnY-GUA核糖体RNA rrn4.5S(2)、rrn5S(2)、rrn16S(2)、rrn23S(2) 翻译起始因子 infA 其他基因 包膜蛋白 cemA 成熟酶 matK C型细胞色素合成 ccsA 乙酰CoA羧化酶亚基 accD 未知功能 开放性阅读框 ycf1(2)、ycf2(2)、ycf3**、ycf4、ycf15(2) 注：(2) 表示两个拷贝；*，含一个内含子；**，含两个内含子。 Notes: (2) indicates two copies; *, Contains one intron; **, Contains two introns. 2.2 滇南青冈密码子使用特征
2.2.1 滇南青冈叶绿体基因组碱基组成
对滇南青冈叶绿体基因组52条CDS不同位置的GC含量以及ENC进行分析，结果显示，GC1、GC2、GC3的平均含量分别为47.12%、39.59%、29.12%，整个编码区的总GC平均含量为38.61%（附表1
1 ）。可见密码子不同位置的GC含量有差异，且GC1 > GC2 > GC3。依据前人研究，ENC值35为区分偏性强弱的标准，该值越小偏性越大，反之，则偏性越小[22]。本研究中，ENC值在38.42 ~ 56.94，平均为47.92（附表1），由此可见，滇南青冈的密码子偏好性较弱。对滇南青冈叶绿体基因组的碱基组成、ENC、密码子数目（Number，N）的相关性进行分析（表3），结果显示，GC1、GC2、GC3均与GCall呈极显著正相关，且GC1与GC2也呈极显著正相关，说明密码子第1、2位的碱基相似；而GC1、GC2分别与GC3相关性不显著，表明密码子第1、2位碱基与第3位碱基的相似度较低；N与GC2呈显著负相关，说明序列长度会影响第2位碱基的GC含量；ENC与GC3呈显著正相关，表明密码子第3位碱基对偏好性影响较大。
表 3 滇南青冈叶绿体基因的GC含量的相关性Table 3. Correlation of GC content of chloroplast genes in Quercus austroglauca项目
ItemGC1 GC2 GC12 GC3 GCall ENC GC2 0.448** GC12 0.868** 0.833** GC3 0.162 0.232 0.229 GCall 0.818** 0.809** 0.955** 0.507** ENC −0.002 −0.251 −0.141 0.319* −0.028 N −0.153 −0.297* −0.260 0.208 −0.167 0.250 注：* 和** 分别表示在0.05和0.01水平上显著相关。 Note: * and ** indicate significant differences at 0.05 and 0.01 level, respectively. 2.2.2 滇南青冈相对同义密码子使用度
对滇南青冈进行RSCU分析（图2），结果显示，64个密码子中，有31个的RSCU > 1，其中以A结尾的有13个，以U结尾的有16个，以C、G结尾的各1个，说明滇南青冈叶绿体基因组使用频率较高的密码子多以A或U结尾。
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图 2 滇南青冈叶绿体基因相对同义密码子使用度分析Figure 2. Analysis of relative synonymous codon usage of chloroplast genes in Quercus austroglauca2.3 滇南青冈密码子偏好性的影响因素
2.3.1 中性绘图分析
中性分析结果显示（图3），GC3分布在0.23 ~ 0.37的区域，GC12则分布在0.33 ~ 0.55的区域，所有基因皆在对角线上方，其中cemA与ycf2基因在对角线附近，而rps11等基因距对角线较远。回归系数（拟合直线斜率）为0.3202，相关系数为0.1744，相关性较弱。结合GC12与GC3的相关性分析，表明滇南青冈叶绿体基因组密码子使用偏性主要受选择的影响（表3、图3）。
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图 3 滇南青冈叶绿体基因的中性绘图分析Figure 3. Neutrality analysis of chloroplast genes in Quercus austroglauca2.3.2 ENC-plot绘图分析
滇南青冈叶绿体多数基因散布于曲线下方，距标准曲线最远的为rps14基因，部分基因位于曲线上，还有极小一部分基因位于曲线上方（图4）。可见，滇南青冈密码子偏好性整体上受选择与突变的共同影响。
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图 4 滇南青冈叶绿体基因组ENC-plot分析Figure 4. ENC-plot analysis of chloroplast genes in Quercus austroglauca为进一步评估滇南青冈密码子偏好性程度，我们计算了ENC比值（表4）。结果显示，52个基因中有18个分布于−0.05 ~ 0.05，即这部分基因距期望ENC值较近，反之，在此区间外的34个基因距期望ENC值较远。若密码子偏性受碱基突变的影响较大，那么多数基因的ENC比值应在−0.05 ~ 0.05。由此可见，滇南青冈叶绿体基因组受选择的影响较大。
表 4 滇南青冈叶绿体基因组ENC比值频数表Table 4. Frequency distribution of ENC ratio in Quercus austroglauca chloroplast genome组限
Class limits组中值
Mid value组数
Frequency No.组频
Frequency−0.15 ~ −0.05 −0.10 2 0.04 −0.05 ~ 0.05 0.00 18 0.35 0.05 ~ 0.15 0.10 22 0.42 0.15 ~ 0.25 0.20 9 0.17 0.25 ~ 0.35 0.30 1 0.02 合计 52 1.00 2.3.3 PR2-plot分析
奇偶偏好（Parity rule 2，PR2）分析结果显示（图5），基因并非均匀地分布于4个象限，有部分基因在中线上，这部分基因主要受突变影响。而图中其他基因离中线较远，受选择影响。其中左下方的psbA基因偏离程度最大，右下方的基因相较其他几个区域来说要多一些，说明滇南青冈叶绿体基因组中A与T、C与G 4种碱基使用不均衡，且G > C，T(U) > A。但如果一般密码子偏好性仅受突变影响，则4种碱基的使用频率理论上应该相等[15]。因此，滇南青冈密码子不仅受突变影响，在很大程度上也受选择的影响。
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图 5 滇南青冈叶绿体基因的PR2-plot分析Figure 5. PR2-plot analysis of chloroplast genes in Quercus austroglauca2.4 最优密码子分析
根据RSCU与ΔRSCU的计算结果（附表2
2 ），筛选到RSCU > 1且ΔRSCU > 0.08的最优密码子13个，分别为UUA、AUU、GUU、GUA、UCU、CCU、ACU、GCU、UAA、CAA、AAA、GAA、UGU。其中以A结尾的密码子有6个，其余皆以U结尾。2.5 多重比较与IR边界分析
以滇南青冈叶绿体基因组为参考，将其与青冈、多脉青冈、小叶青冈、褐叶青冈的叶绿体基因组序列进行多重比较分析。结果显示（图6），5种青冈除了在ycf1基因编码区域变异较大外，其余变异区域主要位于非编码区。IR边界分析表明（图7），在5种青冈中，各边界附近分布的基因一致，但基因序列长度与距边界的距离稍有不同。其中，多脉青冈rps19基因距边界SSC/IRb仅1 bp，其余4种青冈rps19基因皆距该边界11 bp。滇南青冈与小叶青冈、褐叶青冈的trnH基因距IRa/LSC边界15 bp。5种青冈的ndhF基因皆位于SSC区域内，仅多脉青冈的ndhF基因与边界有11 bp的距离。此外，5种青冈IRb区域的ycf1基因片段皆拷贝了其在IRa区域的ycf1片段，这部分拷贝被视为ycf1假基因。
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图 6 5种栎属植物叶绿体基因组多重比较分析Figure 6. Multiple comparative analysis of chloroplast genomes of five Quercus species![]()
图 7 5种栎属植物叶绿体基因组IR边界分析JLB：LSC/IRb 边界；JSB：IRb/SSC 边界；JSA：SSC/IRa 边界；JLA：IRa/LSC 边界。Figure 7. IR boundary analysis of chloroplast genomes of five Quercus speciesJLB: LSC/IRb boundary; JSB: IRb/SSC boundary; JSA: SSC/IRa boundary; JLA: IRa/LSC boundary.2.6 系统发育分析
用MEGA 7软件构建的ML与NJ系统发育树的拓扑结构相同，各分支均有较高的支持率。系统发育树显示（图8），滇南青冈先是与同属的多脉青冈等聚为一支，再同小叶青冈与褐叶青冈聚为一支。其在系统发育树中比多脉青冈等更早分化出来，但又晚于小叶青冈等栎属植物。
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图 8 滇南青冈等13个壳斗科物种系统发育树节点处数字为支持值。左边是ML支持值，右边是NJ支持值。Figure 8. Phylogenetic tree of 13 Fagaceae species, including Quercus austroglaucaNumber at node is support value. Left is ML support value and right is NJ support value.3. 讨论
叶绿体是植物特有的细胞器，具有独立的基因组，而叶绿体基因组因其母系遗传模式，具有高度保守的特性[7, 23]。目前，许多植物的叶绿体基因组已经进行过测序，如北美红栎（Q. rubra L.）[24]、西畴青冈（Q. sichourensis (Hu) C. C. Huang et Y. T. Chang）[25]等，为物种鉴定、亲缘关系分析、密码子偏好性等研究提供了支持。
研究发现，影响密码子偏好性的因素很多，但主要是突变和选择，而GC含量能够反映密码子使用偏好性突变趋势[26]。本研究测序获得了总长度为160 913 bp的滇南青冈叶绿体基因组，并从中筛选出52条符合要求的蛋白编码序列，对其密码子使用偏性及其影响因素进行了系统分析。对滇南青冈叶绿体基因组的研究结果表明，密码子不同位置的GC含量有差异，且GC1 > GC2 > GC3，密码子第3位的GC平均含量仅29.14%，说明滇南青冈叶绿体基因组密码子偏向于以A或U结尾，而RSCU分析与最优密码子的分析结果也印证了这一点。这与同为壳斗科的蒙古栎（Q. mongolica Fischer ex Ledebour）[27]、槲栎（Q. aliena Blume）[27]、米槠（Castanopsis carlesii (Hemsl.) Hayata）[28]等植物叶绿体基因组密码子的使用偏好性一致。此外，相关性分析结果显示，密码子第3位碱基的GC含量与密码子第1、2位相关性不显著，有效密码子与密码子第3位的GC含量呈显著正相关。这与灰毛浆果楝（Cipadessa cinerascens (Pell.) Hand.-Mazz.）[29]、刺五加（Eleutherococcus senticosus (Ruprecht & Maximowicz) Maximowicz）[30]、降香黄檀（Dalbergia odorifera T. Chen）[31]等植物中的研究结果相似，说明密码子第3位的GC含量可作为研究密码子偏好性的依据之一。中性绘图、ENC-plot等分析结果表明，滇南青冈叶绿体基因组的密码子使用偏好性主要受选择影响，其次为突变影响。这一结果与同属的宁冈青冈（Q. ningangensis (W. C. Cheng & Y. C. Hsu) C. C. Huang）[32]、竹叶青冈（Q. neglecta (Schottky) Koidz.）[32]等植物中的研究结果一致，但与澳洲坚果光壳种（Macadamia integrifolia Maiden & Betche）[33]、香花枇杷（Eriobotrya fragrans Champ. ex Benth.）[34]等受选择和突变等多因素共同影响的植物有所不同。另外，PR2-plot分析结果显示，psbA基因是受正向选择影响的高偏好基因。这与宽叶韭（Allium hookeri Thwaites）、峨眉韭（A. omeiense Z. Y. Zhu）[35]中的研究结果相似，但与棉属（Gossypium）[36]植物中的研究结果不同。因此，我们推测，不同属或科中受选择的高偏好基因可能存在差异，这种差异可能是影响其适应性的重要因素。
栎属植物主要根据果实特征进行鉴定，在没有果实的情况下，想要鉴定到具体物种十分困难。而本研究发现，5种栎属植物ycf1、ropC1等基因发生变异的区域可作为DNA条形码进行开发，为栎属植物的鉴定提供依据。IR边界分析表明，5种栎属植物的叶绿体基因组成相同，滇南青冈与青冈等并无显著差异，它们的IR边界都很保守且有ycf1假基因。该假基因在壳斗科植物中较为常见[32]。系统发育分析显示，滇南青冈在系统发育树中处于小叶青冈与多脉青冈两支栎属植物之间，与多脉青冈等亲缘关系较近。
本研究获得的滇南青冈叶绿体基因组充实了栎属植物的叶绿体基因库，但因黄枝青冈、龙迈青冈等栎属植物缺乏叶绿体基因组数据，所以未能对它们进行系统发育分析，因此滇南青冈的分类地位仍有争议。在今后的研究中，应对栎属植物的叶绿体基因库进行完善，以便从分子角度明确栎属植物的分类地位。本文对滇南青冈叶绿体基因组结构特征、密码子偏好性及其影响因素的分析结果，可为后续的种源鉴定、栎属植物系统发育等研究提供参考。
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图 2 圆柏快速光响应曲线参数比较
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
Figure 2. Comparison of fast light response curve parameters in Sabina chinensis
Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).
表 1 4种光合参数的日变化
Table 1 Comparison of four photosynthetic parameters
参数
Parameter性别
Sex叶形
Leaf
shape时间
Time8：00 10：00 12：00 14：00 16：00 18：00 Pn / μmol·
m−2·s−1雄株 刺叶 1.2±0.10b（A） 3.5±0.10b（A） 1.7±0.10b（A） 0.4±0.02b（A） 0.9±0.20b（A） 0.1±0.10c（B） 鳞叶 0.7±0.05B（B） 2.2±0.30A（B） 1.2±0.10B（B） 0.2±0.03B（B） 0.7±0.04C（A） 0.3±0.03B（A） 雌株 刺叶 2.2±0.15a（A） 4.7±0.30a（A） 2.9±0.23a（A） 0.6±0.06a（A） 2.8±0.30a（A） 0.9±0.05a（A） 鳞叶 0.8±0.08B（B） 2.8±0.34A（B） 1.4±0.07A（B） 0.5±0.01A（B） 1.3±0.13B（B） 0.3±0.03C（B） 雌雄
同株刺叶 0.7±0.04c（B） 1.8±0.21c（B） 0.5±0.05c（B） 0.2±0.08c（B） 0.9±0.17b（B） 0.3±0.01b（B） 鳞叶 1.2±0.12A（A） 2.7±0.21A（A） 0.9±0.08C（A） 0.6±0.06A（A） 1.5±0.12A（A） 0.8±0.02A（A） Gs / mmol·
m−2·s−1雄株 刺叶 18.0±0.80a（A） 25.6±2.20a（A） 19.7±1.20b（A） 25.7±1.50a（A） 15.3±1.00b（A） 10.1±0.70a（B） 鳞叶 15.0±0.90A（B） 25.9±1.70A（A） 11.5±2.40B（B） 19.1±2.10A（B） 15.6±2.10A（A） 14.2±0.80A（A） 雌株 刺叶 19.1±1.10a（A） 22.1±1.80a（A） 24.4±1.50a（A） 17.5±1.20b（A） 29.9±1.10a（A） 10.8±0.70a（A） 鳞叶 15.3±1.00A（B） 23.1±1.40A（A） 21.1±2.10A（A） 17.7±1.20A（A） 17.8±1.50A（B） 9.8±0.99B（A） 雌雄
同株刺叶 14.0±0.90b（A） 20.1±2.10a（A） 17.0±1.60b（B） 15.0±1.30b（B） 18.0±1.80b（A） 9.9±0.56a（A） 鳞叶 14.0±0.90A（A） 23.1±3.00A（A） 23.0±1.40A（A） 21.0±1.90A（A） 19.0±1.40A（A） 11.0±0.90B（A） Tr / mmol·
m−2·s−1雄株 刺叶 0.4±0.02a（A） 1.1±0.03a（B） 1.4±0.05a（A） 1.7±0.08a（A） 0.9±0.08b（A） 0.4±0.03a（B） 鳞叶 0.3±0.05A（B） 1.2±0.06A（A） 0.8±0.04B（B） 1.0±0.03C（B） 0.7±0.04A（B） 0.7±0.09A（A） 雌株 刺叶 0.4±0.15a（A） 0.7±0.07c（A） 0.8±0.12b（B） 1.3±0.06b（B） 1.1±0.09a（A） 0.3±0.05b（B） 鳞叶 0.3±0.08A（A） 0.9±0.14B（A） 1.0±0.07A（A） 1.4±0.01A（A） 0.8±0.13A（B） 0.4±0.03B（A） 雌雄
同株刺叶 0.2±0.04b（A） 0.9±0.11b（A） 0.6±0.05c（B） 1.0±0.08c（B） 0.8±0.07b（A） 0.3±0.01b（A） 鳞叶 0.3±0.12A（A） 0.7±0.09B（A） 0.8±0.08B（A） 1.3±0.06B（A） 0.8±0.12A（A） 0.3±0.02C（A） WUE /
mmol/
mol雄株 刺叶 3.0±0.10c（A） 2.7±0.18b（A） 0.7±0.10b（B） 0.2±0.04b（A） 1.0±0.20b（A） 0.3±0.10c（B） 鳞叶 2.3±0.05C（B） 1.6±0.30C（B） 0.9±0.10A（A） 0.2±0.02B（A） 1.0±0.04C（A） 0.5±0.03B（A） 雌株 刺叶 5.5±0.15a（A） 5.3±0.30a（A） 3.5±0.23a（A） 0.5±0.06a（A） 2.5±0.30a（A） 2.7±0.05a（A） 鳞叶 2.7±0.18B（B） 2.6±0.34B（B） 1.4±0.27A（B） 0.4±0.11A（B） 1.8±0.13B（B） 0.7±0.17B（B） 雌雄
同株刺叶l 3.3±0.04b（B） 2.0±0.21c（B） 0.8±0.05b（B） 0.2±0.08b（B） 1.2±0.17b（B） 1.1±0.01b（B） 鳞叶 3.9±0.12A（A） 3.7±0.24A（A） 1.1±0.18A（A） 0.4±0.12A（A） 2.0±0.12A（A） 2.5±0.13A（A） 注：不同小写字母表示同一参数下刺叶3种性别间差异显著，不同大写字母表示同一参数下鳞叶3种性别间差异显著，括号内不同大写字母表示同一参数下各性别鳞、刺叶间差异显著（P<0.05）。 Notes: Different lowercase letters indicate significant differences between sexes of prickly leaves under the same parameter, different uppercase letters indicate significant differences between sexes of scaly leaves under the same parameter, and different uppercase letters in parentheses indicate significant differences between sexes of scaly and prickly leaves under the same parameter (P<0.05). 
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表 2 不同性别圆柏异形叶叶绿素荧光参数
Table 2 Chlorophyll fluorescence parameters of heterophyllous leaves of different sexes in Sabina chinensis
叶形
Leaf shape性别
Sex最大光化光效率
Fv/Fm实际电子传递速率
ETR实际光化光效率
ФPSⅡ光化学淬灭系数
qP非光化学淬灭系数
NPQ光能捕获能力
1/Fo−1/Fm刺叶 雄株 0.78±0.014b 23.60±1.248c 0.22±0.011b 0.41±0.014b 1.96±0.165a 1.71±0.145c 雌株 0.78±0.013b 21.36±1.700d 0.20±0.016b 0.37±0.015c 2.12±0.126a 1.97±0.169b 雌雄同株 0.78±0.009b 24.65±0.150c 0.23±0.001b 0.41±0.003b 1.82±0.180ab 2.35±0.198a 鳞叶 雄株 0.81±0.010a 30.44±3.440a 0.28±0.046a 0.47±0.021a 1.63±0.129b 1.58±0.164d 雌株 0.78±0.011b 27.56±1.190b 0.26±0.030ab 0.44±0.020ab 2.01±0.141a 1.63±0.092cd 雌雄同株 0.80±0.002a 24.25±0.530c 0.22±0.039b 0.42±0.036b 2.07±0.113a 2.21±0.204a 注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05).
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表 3 不同叶片非结构性碳水化合物含量
Table 3 Non-structural carbohydrate content in different leaves
性别
Sex叶形
Leaf shape可溶性糖
SS / mg/g淀粉
ST / mg/g非结构性碳水化合物
NSC / mg/g雄株 刺叶 66.33±3.17aB 23.76±1.93aA 90.09±5.10aB 鳞叶 69.20±3.37aA 14.67±2.53bB 83.87±5.90bB 雌株 刺叶 74.58±2.65aA 24.92±2.06aA 99.50±4.71aA 鳞叶 65.70±3.62bAB 21.65±2.11bA 87.34±5.73bA 雌雄同株 刺叶 55.37±4.38aC 22.03±1.80aA 77.40±6.19aC 鳞叶 61.50±3.65bB 20.39±1.28aA 81.89±4.93bB 注：不同小写字母表示相同性别下不同叶形间存在显著差异；不同大写字母表示相同叶形下不同性别间存在显著差异， P<0.05。 Notes: Different lowercase letters indicate significant differences between different leaf shapes in the same sex; different capital letters indicate significant differences between different sexes with the same leaf shape, P<0.05.
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